1. Capiscenza iniziale

À questu stadiu, avemu bisognu di capiscenu certi cuncetti è terminologie, per ùn fà sbaglià davanti à i nostri anziani, cum'è:

Q: Chì hè a differenza trà RT-PCR, qPCR, PCR in tempu reale è RT-PCR in tempu reale?

Risposta: RT-PCR è PCR di trascrizione inversa(PCR di trascrizione inversa, RT-PCR), chì hè una variante largamente usata di a reazione in catena di polimerasi (PCR).In RT-PCR, un filu di RNA hè trascrittu inversamente in DNA cumplementariu, chì hè dopu usatu cum'è mudellu per l'amplificazione di DNA da PCR.
PCR in tempu reale è qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) sò a stessa cosa, tramindui sò PCR quantitative in tempu reale, chì significa chì ogni ciculu di PCR hà records di dati in tempu reale, cusì u numeru di mudelli di partenza pò esse aghjustatu analisi precisa.

Ancu se a PCR in tempu reale (PCR quantitativa fluorescente in tempu reale) è a PCR di trascrizione inversa (PCR di trascrizione inversa) sembrano abbreviate come RT-PCR, a convenzione internazionale è: RT-PCR si riferisce specificamente a trascrizione inversa.PCR, PCR in tempu reale hè generalmente abbreviatu cum'è qPCR (PCR quantitativa in tempu reale).

È RT-PCR in tempu reale (RT-qPCR), hè a PCR di trascrizione inversa cumminata cù a tecnulugia quantitativa fluorescente.: prima uttene cDNA (RT) da a trascrizione inversa di RNA, è dopu aduprà PCR in tempu reale per l'analisi quantitativa (qPCR).A maiò parte di i laboratorii facenu RT-qPCR, vale à dì, a ricerca nantu à a regulazione di l'espressione di RNA, cusì u qPCR chì tutti parlanu in u laboratoriu in realtà si riferisce à RT-qPCR, ma ùn vi scurdate chì ci sò sempre assai teste di DNA in applicazioni cliniche.Analisi quantitativa, cum'è a rilevazione di l'hepatitis B virus HBV.

Quistione: Dopu avè lettu assai PCR quantitativa fluorescente, perchè u frammentu amplificatu deve esse cuntrullatu in a gamma di 80-300bp?

Rispondi: A durata di ogni sequenza di geni hè diversu, alcuni sò parechji kb, alcuni sò centinaie di bp, ma avemu solu bisognu di dumandà a lunghezza di u produttu per esse 80-300bp quandu cuncepisce primers, troppu cortu o troppu longu ùn sò micca adattati per a rilevazione di PCR quantitativa fluorescente.U frammentu di u pruduttu hè troppu cortu per esse distintu da u primer-dimer.A durata di u primer-dimer hè di circa 30-40bp, è hè difficiule di distingue s'ellu hè un primer-dimer o un pruduttu s'ellu hè menu di 80bp.Se u frammentu di u produttu hè troppu longu, sopra à 300bp, facilmente porta à una efficienza di amplificazione bassa è ùn pò micca detectà in modu efficace a quantità di u genu.

Per esempiu, quandu cuntate quante persone sò in una aula, basta à cuntà quante bocche ci sò.U stessu hè veru quandu detecte i geni, avete solu bisognu di detectà una certa sequenza di un genu per rapprisintà A sequenza sana farà.Se vulete cuntà e persone, avete bisognu di cuntà a bocca è u nasu, l'arechje è i vetri, è hè faciule fà sbaglià.

Per espansione, in a ricerca biologica, ci sò parechji casi di ricerca da u puntu à l'area, perchè a sequenza di geni di ogni spezia hè assai longa, ùn hè micca necessariu è impussibule di misurà tutti i frammenti, cum'è a sequenza di bacterial 16S, chì hè di rializà a sequenza conservativa di battìri Assays per inferisce u numeru di una certa populazione di bacteria.

Q: Quale hè a lunghezza ottimale per u disignu di l'amori qPCR?

Rispondi: In generale, a lunghezza di prima hè di circa 20-24bp, chì hè megliu.Di sicuru, duvemu attente à u valore TM di u primu quandu u disignu di u primu, perchè questu hè in relazione cù a temperatura d'anneling ottimali.Dopu assai spirimenti, hè statu pruvata chì 60 ° C hè un valore TM megliu.Se a temperatura di annealing hè troppu bassu, facilmente porta à l'amplificazione non specifica.Se a temperatura di annealing hè troppu alta, l'efficienza di amplificazione serà relativamente bassu, u piccu di a curva di amplificazione principia più tardi, è u valore CT serà ritardatu.

Q: Cumu hè u metudu di tintura diversu da u metudu di sonda?

Risposta: Metudu di tinturaCerti coloranti fluoriscenti, cum'è SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., ùn emettenu micca luce per elli stessi, ma emettenu fluoriscenza dopu à ubligatoriu à u groove minore di DNA doppia filamentu.Dunque, à u principiu di a reazione PCR, a macchina ùn pò micca detectà u signale fluorescente.Quandu a reazione righjunghji u stadiu di annealing-extension, a doppia fila hè aperta, è una nova fila hè sintetizzata sottu l'azzione di l'ADN polimerasi, è a molécula fluorescente si lega à u groove minore dsDNA.Quandu u numeru di cicli di PCR aumenta, più è più tinti sò cumminati cù DNA à doppia fila, è u signale fluorescente hè ancu rinfurzatu continuamente.U metudu di tintura hè principalmente utilizatu in a ricerca scientifica.
PS: Attenti quandu fate l'esperimentu, a tintura deve esse cumminata cù l'ADN umanu, fate cura di trasfurmà in una persona fluorescente.

Metudu di tintura (a manca) Metudu di sonda (a diritta)
PS: Attenti quandu fate l'esperimentu, a tintura deve esse cumminata cù l'ADN umanu, fate cura di trasfurmà in una persona fluorescente.

SYBR Green Ⅰ si lega à u groove minore di DNA

Metudu di sondaA sonda Taqman hè a sonda di idrolisi più usata.Ci hè un gruppu fluorescente à l'estremità 5' di a sonda, di solitu FAM, è a sonda stessa hè una sequenza cumplementaria di u genu di destinazione.Ci hè un gruppu di quenching fluorescente à l'estremità 3'.Sicondu u principiu di u trasferimentu di energia di risonanza di fluorescenza (Förster resonance energy transfer, FRET), quandu u gruppu fluorescente reporter (molecula fluorescente donatore) è u gruppu fluorescente quenching (molecula fluorescente accettatore) sò eccitati Quandu l'spettri si sovrapponenu è a distanza hè assai vicina (7-10nm), l'excitazione di a molecula fluorescente accetta mentre l'eccitazione di a molecula fluorescente in l'autofluorescenza. nce hè debilitatu.Dunque, à l'iniziu di a reazione PCR, quandu a sonda hè libera è intacta in u sistema, u gruppu fluoriscente di u reporter ùn emette micca fluoriscenza.Quandu l'annealing, u primer è a sonda si liganu à u mudellu.Durante a fase di estensione, a polimerasi sintetizza continuamente novi catene.L'ADN polimerasi hà attività di esonucleasi 5'-3'.Quandu ghjunghje à a sonda, l'ADN polimerasi idrolizzarà a sonda da u mudellu, separà u gruppu fluorescente di u reporter da u gruppu fluorescente di quencher, è libera u signale fluorescente.Siccomu ci hè una relazione unu à unu trà a sonda è u mudellu, u metudu di sonda hè superiore à u metudu di tintura in quantu à a precisione è a sensibilità di a prova.U metudu di sonda hè principarmenti utilizatu in u diagnosticu.

Q: Chì ghjè a quantificazione assoluta?Cosa hè a Quantificazione Relativa?

Rispondi: A quantificazione assoluta si riferisce à u calculu di u numeru di copia iniziale di a mostra per esse pruvata da qPCR, cum'è quanti virus HBV sò in 1ml di sangue.U risultatu ottenutu da a quantificazione relativa hè u cambiamentu in a quantità di u genu di destinazione in una mostra specifica relative à un'altra mostra di riferimentu, è l'espressione genica hè regulata o regulata.

Q: A quantità di l'estrazione di RNA, l'efficienza di a trascrizione inversa è l'efficienza di amplificazione affettanu i risultati sperimentali?
Q: L'almacenamiento di campioni, i reagenti di estrazione, i reagenti di trascrizione inversa è i consumabili di trasmissione di luce affettanu i risultati sperimentali?
Q: Chì mètudu pò curregge i dati spirimintali?

Riguardu à sti prublemi, avemu da discriverà in dettaglio in e rùbbriche avanzate è avanzate sottu.
2. Cunniscenza avanzata

In quantu à a PCR quantitativa fluoriscente in tempu reale, duvemu ricunnosce a realità chì millaie di documenti di ricerca scientifica sò publicati ogni annu, trà quale a tecnulugia PCR quantitativa fluorescente ùn hè micca un picculu numeru.

Se ùn ci hè micca un standard cumuni per misurà l'esperimentu di PCR quantitativa fluorescente, i risultati pò varià assai.Per u stessu genu di a listessa spezia, cù u stessu metudu di trasfurmazioni, i risultati di a deteczione varieranu ancu assai, è serà difficiule per i ritardati di ripetiri i stessi risultati.You Nimu sà quale hè ghjustu è quale hè sbagliatu.

Questu significa chì a PCR quantitativa fluorescente hè una tecnulugia ingannata o una tecnulugia inaffidabile?No, hè perchè a PCR quantitativa fluorescente hè più sensibule è più precisa, è un pocu operazione sbagliata pruducerà risultati completamente opposti.Una piccula perdita hè à mille chilometri di distanza.L'autore di l'articulu pò esse ripetutamente torturatu da i critichi.À u listessu tempu, i revisori di u ghjurnale sò ancu difficiuli di sceglie di diversi risultati sperimentali.

In tuttu, indicà una mancanza di cunsensu in esperimenti PCR in tempu reale.Per questu scopu, i scientisti anziani in l'industria cuminciaru à furmulà standard,Esigendu i cuntributori à furnisce alcuni dettagli sperimentali è di trasfurmazioni di dati necessarii (cumpresi i dati necessarii) in l'articulu per risponde à questi standard.

I rivisori ponu ghjudicà a qualità di l'esperimentu leghjendu sti dettagli;i futuri lettori ponu ancu aduprà questu per ripetiri l'esperimentu o migliurà l'esperimentu.Allora i risultati spirimintali ottenuti in questu modu sò pieni di informazioni, d'alta qualità è utilizable.

MIBBI (Informazioni Minimu per Investigazioni Biologiche è Biomedicali -http://www.mibbi.org) hè natu.MIBBI hè un prughjettu chì furnisce standard per esperimenti.Hè publicatu in natura.Stu prughjettu hè destinatu à diversi esperimenti biologichi, cumprese a biologia cellulare, Microarray, qPCR chì avemu da discutiri avà, etc., è furnisce per ogni tipu di esperimentu quandu sottumettenu manuscritti.Questa infurmazione deve esse furnita in ogni mumentu.

In u prughjettu MIBBI, ci sò dui articuli ligati à a PCR quantitativa fluorescente, vale à dì:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - una lingua strutturata è guida di rapportu per i dati PCR quantitativi in ​​tempu reale;
·MIQE (Informazioni Minimu per Publicazione di Esperimenti PCR Quantitative Real-Time) - infurmazione minima per publicà articuli nantu à esperimenti PCR quantitativi in ​​tempu reale.
Prima, parlemu di RDML, a specificazione terminologica.

Se ùn ci hè micca una definizione standard per tuttu, hè impussibile di cuntinuà a discussione, per quessa chì a spiegazione di i termini hè cusì impurtante in l'esame.
A terminologia utilizata in l'esperimentu PCR quantitativa fluorescente include u cuntenutu seguente.QIAGEN hà fattu u megliu riassuntu per noi.I seguenti sò tutti secchimerchenzie .

Curva di amplificazione
A curva di amplificazione si riferisce à a curva fatta durante u prucessu di PCR, cù u numeru di ciculu cum'è l'abscissa è l'intensità di fluorescenza in tempu reale durante a reazione cum'è l'ordinata.

Una curva di amplificazione eccellente deve avè e seguenti caratteristiche: a linea di basa hè piatta o ligeramente diminuita, è ùn ci hè micca una tendenza ascendente evidente;u puntu d'inflessione di a curva hè chjaru, è a pendenza di a fase esponenziale hè proporzionale à l'efficienza di amplificazione.A più grande a pendenza, u più altu l'efficienza di amplificazione;a curva di amplificazione generale U parallelismu hè bonu, chì indica chì l'efficienza di amplificazione di ogni tubu hè simile;a fase esponenziale di a curva di amplificazione di campioni di bassa cuncentrazione hè ovvia.

Baseline (Baseline)
A basa hè u nivellu di rumore di u ciclu iniziale, generalmente misurata trà u 3 è u 15 ciculu, perchè l'aumentu di u valore di fluoriscenza causatu da u pruduttu di amplificazione ùn pò micca esse rilevatu durante stu periodu.U nùmeru di ciculi utilizati per calculà a basa di basa pò esse variata è pò esse ridutta si sò usati quantità elevate di mudelli o se u livellu di espressione di u genu di destinazione hè altu.

L'impostazione di a linea di base richiede a visualizazione di dati di fluorescenza da a curva di amplificazione di linearità.A basa hè stabilita in modu chì a crescita di a curva di amplificazione principia cù un numaru di ciculu più grande di u numeru di u ciculu di basa.E linee di basa deve esse stabilite individualmente per ogni sequenza di destinazione.I valori di fluoriscenza media rilevati in i primi cicli deve esse sottratti da i valori di fluoriscenza ottenuti in i prudutti amplificati.L'ultime versioni di vari software di PCR in Real-Time permettenu l'ottimisazione automatica di i paràmetri di basa per i campioni individuali.

Duranti i primi ciculi di a reazione di amplificazione PCR, u signale di fluoriscenza ùn cambia assai.Avvicinà una linea recta hè chjamata a linea di basa, ma se guardemu attentamente à i primi ciculi, vedemu chì in a linea di basa hè ciò chì succede in a stampa sottu.

Sfondate si riferisce à
u valore di fluorescenza non specificu in a reazione.Per esempiu: inefficient fluorescence quenching;o un gran numaru di mudelli di DNA doppia filamentu per via di l'usu di SYBR Green.I cumpunenti di u fondu di u signale sò matematicamente eliminati da l'algoritmu di u software PCR Real-Time.

Segnale di reporter
U signale reporter si riferisce à u signale fluorescente generatu da SYBR Green o sonde specifiche di sequenza marcate fluorescente durante a PCR in Tempu Reale.

Segnale di Reporter Normalizatu (RN)
RN si riferisce à l'intensità di fluorescenza di a tintura di reporter divisa da l'intensità di fluorescenza di a tintura di riferimentu passiva misurata à ogni ciclu.

Tintura di Riferenza Passiva
In certi PCR in tempu reale,a tintura fluoriscente ROX hè usata cum'è riferimentu internu per nurmalizà u signale fluoriscente.Corrige per variazioni dovute à pipettazione imprecisa, pusizioni di pozzu è fluttuazioni di fluorescenza nantu à una basa bè per pozzu.

U sogliu di fluorescenza (threshold)
hè statu aghjustatu sopra u valore di fondo è significativamente sottu à u valore di u plateau di a curva di amplificazione.Hè deve esse situatu in a regione lineale di a curva di amplificazione, chì rapprisenta u log-linear range di deteczione PCR.I soglia deve esse stabilitu in a vista di a curva di log-amplificazione in modu chì a fase log-linear di PCR hè facilmente identificabile.Se ci sò parechji geni di destinazione in a PCR in Tempu Reale, u sogliu deve esse stabilitu per ogni mira.In generale, u signale di fluorescenza di i primi 15 cicli di reazione PCR hè utilizatu cum'è u signale di fondo di fluorescenza, è a soglia di fluorescenza hè 10 volte a deviazione standard di u signale di fluorescenza di i primi 3 à 15 cicli di PCR, è a soglia di fluorescenza hè stabilita in a fase di amplificazione esponenziale di PCR.In generale, ogni strumentu hà u so limitu di fluoriscenza stabilitu prima di l'usu.

Soglia di Ciclu (CT) o Puntu di Crossing (CP)
U ciculu in u quale a curva di amplificazione attraversa u limitu (vale à dì, u puntu à quale a rilevazione di fluorescenza aumenta significativamente).CT pò esse una frazzioni è a quantità di mudellu di partenza pò esse calculata.U valore CT rapprisenta u numeru di ciculi sperimentati quandu u signale fluorescente in ogni tubu di reazione PCR righjunghji u limitu stabilitu.Ci hè una relazione lineare trà u valore CT di ogni mudellu è u logaritmu di u numeru di copia iniziale di u mudellu, upiù altu u numeru di copia iniziale, u più chjucu u valore CT, è vice versa.Una curva standard pò esse fatta usendu un standard cun u numeru di copia iniziale cunnisciutu, induve l'abscissa rapprisenta u valore CT, è l'ordinata rapprisenta u logaritmu di u numeru di copia iniziale.Dunque, finu à chì u valore CT di a mostra scunnisciuta hè ottenuta, u numeru di copia iniziale di a mostra pò esse calculatu da a curva standard.

valore ΔCT
U valore ΔCT descrivea diffarenza trà u genu di destinazione è u valore CT di u gene di riferimentu endogenu currispundente, cum'è un genu di a casa, è hè utilizatu per nurmalizà a quantità di mudellu utilizatu:
⇒ΔCT = CT (gene di destinazione) - CT (gene di riferimentu endogenu)

ΔΔCT Valeur
U valore ΔΔCT descrive a diffarenza trà u valore ΔΔCT mediu di una mostra d'interessu (per esempiu, cellule stimulate) è u valore mediu ΔΔCT di un campione di riferimentu (per esempiu, cellule non stimulate).A mostra di riferimentu hè ancu chjamata mostra di calibrazione è tutti l'altri campioni sò normalizzati à questu per a quantificazione relativa:
⇒ΔΔCT = ΔCT mediu (campionu d'interessu) - ΔCT mediu (campione di riferimentu)

Geni di riferimentu endogeni (geni di riferimentu endogeni)
I livelli d'espressione di i geni di riferimentu endogeni, cum'è i geni di a casa (geni di a casa), ùn sò micca diffirenti trà e mostre.Paragunendu i valori CT di u genu di riferimentu à u genu di destinazione permette à u livellu di espressione di u genu di destinazione esse normalizatu à a quantità di RNA di input o cDNA (vede a sezione nantu à i valori ΔCT sopra).

Geni di riferimentu internu currettu perPossibile degradazione di l'RNA o a presenza di inibitori enzimatici in campioni di RNA, è ancu variazioni in u cuntenutu di RNA, l'efficienza di a trascrizione inversa, a ricuperazione di l'acidu nucleicu è a manipulazione di campioni.Per selezziunà u gene (s) di riferimentu ottimali, avemu mudificatu l'algoritmu per permette a so selezzione di u riferimentu ottimale dipende da u paràmetru sperimentale.

U cuntrollu internu
Una sequenza di cuntrollu chì hè amplificata in a stessa reazione cum'è a sequenza di destinazione è sondata cù una sonda diversa (vale à dì, eseguendu PCR duplex).I cuntrolli interni sò spessu usati per escludiri amplificazioni falluti, cum'è quandu a sequenza di destinazione ùn hè micca rilevata.
Campione di calibrazione
Un campione di riferimentu (per esempiu, RNA purificatu da una linea cellulare o tissutu) utilizatu in quantificazione relativa per paragunà tutti l'altri campioni per determinà u livellu di espressione relative di un genu.A mostra di calibrazione pò esse qualsiasi mostra, ma hè di solitu un cuntrollu (per esempiu, una mostra micca trattata o una mostra da u tempu zero di l'esperimentu).

Cuntrolli pusitivi
aduprà riazzioni di cuntrollu cùquantità cunnisciute di mudellu.I cuntrolli pusitivi sò spessu usati per verificà chì un set di primer o un set di primer-sonda funziona bè è chì a reazione hè stallata currettamente.

Nisun cuntrollu di mudellu (NTC)
Una reazzione di cuntrollu chì cuntene tutti i cumpunenti necessarii di a reazzione di amplificazione eccettu u mudellu, chì hè generalmente rimpiazzatu cù l'acqua.L'usu di NTC pò truvà a contaminazione causata da a contaminazione di reagenti o DNA straneru, assicurendu cusì l'autenticità è l'affidabilità di e dati di rilevazione.L'amplificazione di u cuntrollu NTC indica a contaminazione.

Nisun cuntrollu RT (NRT)
U prucessu d'estrazione di RNA pò cuntene DNA genomicu residuale, chì hè estremamente dannosu è hè u culpitu chì affetta a qualità di dati è l'inimicu naturali di qPCR, per quessa, quandu si cuncepisce esperimenti, deve esse pensatu per amplificà solu a rilevazione di RNA.Ci hè dui manere, unu hè di disignà primers attraversu introni, l'altru hè di sguassà completamente l'ADN, quale hè megliu, chì serà discututu dopu.U cuntrollu NTR hè un specchiu magicu per detectà a contaminazione di DNA.Se ci hè amplificazione, significa chì ci hè contaminazione.

Norme
I standard sò campioni di cuncentrazione cunnisciuta o numeru di copia chì sò usati per custruisce una curva standard.Per assicurà a stabilità di u standard, u frammentu di u genu hè generalmente clonatu in u plasmide è utilizatu cum'è standard.

A curva standard
hè generalmente diluted in almenu 5 gradienti di cuncentrazione cù u pruduttu standard secondu u rapportu di radduppiamentu, è 5 punti sò disegnati in e coordenate di u valore CT è u numeru di copia, è i punti sò cunnessi per furmà una linea per generà una curva standard.Per ogni curva standard, a so validità deve esse verificata.U valore di a pendenza hè trà -3,3 è -3,8, è ogni cuncentrazione hè realizatu in triplicate.I punti chì sò significativamente sfarente da altri punti deve esse scartati.U valore CT di a mostra per esse pruvata hè purtatu in a curva standard, è u livellu di espressione di a mostra per esse pruvata pò esse calculatu.

U valore CT di a mostra per esse pruvata hè purtata in a curva standard, è u numeru di copia iniziale di a mostra per esse pruvatu pò esse calculatu.

Efficienza è Pendenza
A pendenza di a curva standard rapprisenta l'efficienza di a PCR in tempu reale.
·Una pendenza di -3.322 indica chì l'efficienza di amplificazione PCR hè 1, o 100% efficaci, è a quantità di produttu PCR radduppia à ogni ciculu.
·Una pendenza menu di -3,322 (per esempiu, -3,8) indica un'efficienza di PCR
·Una pendenza più grande di -3.322 (per esempiu, -3.0) indica chì l'efficienza di a PCR pare esse più grande di 100%, chì hè curiosu, cumu puderia un ciclu di PCR generà più di u doppiu di u pruduttu amplificatu?Sta situazione si trova in a fase non lineale di a reazione PCR, vale à dì, ci hè una grande quantità di amplificazione non specifica.

curva di fusione
Dopu chì l'amplificazione qPCR hè finita, u pruduttu PCR hè riscaldatu.Quandu a temperatura aumenta, u pruduttu di l'amplificazione à doppia fila si fonde gradualmente, risultatu in una diminuzione di l'intensità di fluorescenza.Quandu una certa temperatura (Tm) hè ghjunta, un gran numaru di prudutti si funnu.A fluorescenza scende bruscamente.Diversi prudutti di PCR anu diverse valori di Tm è diverse temperature di fusione, cusì chì a specificità di a PCR pò esse identificata.

Curva di fusione (curva derivata)
A curva di fusione hè derivata per furmà una mappa di u piccu, chì pò visualizà più intuitivamente a situazione di i frammenti di u produttu PCR.Siccomu a temperatura di fusione hè u valore Tm di u frammentu di l'ADN, certi paràmetri chì affettanu u valore Tm di u frammentu di l'ADN ponu esse ghjudicati, cum'è a dimensione di u frammentu, u cuntenutu GC, etc.a durata di u pruduttu amplificatu hè in a gamma di 80-300bp, cusì a temperatura di fusione deve esse trà 80 ° C è 90 ° C.

Interpretazione di a curva di fusione: Se l'unicu piccu principale appare trà 80 ° C-90 ° C, significa chì a PCR quantitativa fluorescente hè perfetta;se u piccu principale si prisenta trà 80 ° C-90 ° C è i picchi miscellanei appariscenu sottu à 80 ° C, u dimeru di primariu hè basamente cunsideratu.Pudete pruvà à aumentà a temperatura di annealing per risolve;s'è u piccu principale cumparisce trà 80 ° C-90 ° C, è u piccu miscellaneous cumparisce di novu quandu a temperatura s'arrizza, hè in fondu cunziddiratu chì ci hè a contaminazione di l'ADN, è l'ADN deve esse cacciatu in u stadiu iniziale di l'esperimentu.

Di sicuru, ci sò sempre certi situazioni anormali, chì seranu spartuti unu per unu sottu.
3. Cunniscenza avanzata

Per fà qPCR, aghju da dì MIQE,Informazione minimaper a Publicazione diQuantitativePCR in tempu realeEsperimenti - l'infurmazione minima per publicà articuli nantu à a PCR quantitativa in tempu realeesperimenti.Per simplificà l'intelligenza di tutti, simplificà u cuntenutu chjave.

Pudete cercà u testu uriginale di MIQE in Internet, è u più impurtante hè chì stipula uLista di cuntrollu di dati chì deve esse furnitu quandu pubblicà un articulu .

I rivisori ponu ghjudicà a qualità di l'esperimentu leghjendu sti dettagli;i futuri lettori ponu ancu aduprà questu per ripetiri o migliurà l'esperimentu.
Hè da nutà chì in questa lista, l'impurtanza di ogni lista hè marcata cù E o D rispettivamente.Cosa significa?E: infurmazione essenziale (deve esse presentata);D: infurmazione desiderata (furnite quantu pussibule).

MIQE (1) - Disegnu Sperimentale
Parechje scumbags chì anu finitu a so difesa dopu à finisce i so studii graduate ùn sanu micca cumu cuncepisce un esperimentu indipindente, apre i so libretti, è fà ciò chì u maestru li dice di fà.In u risultatu, u disignu spirimintali ùn era micca rigurosu, è u dipartimentu editoriale di a rivista hà dettu chì vulianu fà sta stampa è quella stampa, cusì l'anu fattu in un daze.Eccu cumu si facenu i scumbags !

Più vicinu à a casa, u primu principiu di l'esperimentu hè di determinàu rigore di a logica spirimintali.A cosa più fundamentale hè u disignu spirimintali, è u più impurtante nantu à u disignu spirimintali hè cumu si stabilisce a mostra di destinazione, a mostra di riferimentu (cuntrollu), è u nùmeru di ripetizioni, in modu chì e dati spirimintali ponu esse riferiti, cumparabile è cunvince.

U campione di destinazionesi riferisce à a mostra chì ci impone di detectà u genu di destinazione dopu un certu trattamentu.A mostra di riferimentuhè a mostra senza trattamentu, chì hè spessu chjamatu tipu salvaticu in biologia.

Replica sperimentalesò assai impurtanti.In generale, u numaru di replicati persuasivi deve esse più di trè.Hè necessariu di distinguishà ciò chì hè a replicazione biologica è ciò chì hè a replicazione tecnica.

Replicati Biològichi: U stessu esperimentu di verificazione fattu cù diversi materiali (tempu, piante, batch, platti di reazzione).

Duplicazione biologica
Pigliemu u trattamentu di pesticidi di pepite per esempiu.Vulemu spray pesticidi nantu à e trè piante di ABC, allora e trè piante di ABC sò trè replicati biològichi, è sò u stessu esperimentu di verificazione realizatu cù materiali diffirenti.Ma cum'è un esperimentu, un cuntrollu hè definitu bisognu, perchè pudemu spruverà una di e rami di a pianta A per furmà un gruppu spirimintali di a pianta A, è micca spruzzate l'altri rami di a pianta A per furmà un gruppu di cuntrollu.Fate u listessu per B è C.

Replicate tecniche (Replicate tecniche): Hè un esperimentu ripetutu pensatu per evità l'errori causati da u funziunamentu, chì hè in realtà un foru duplicatu inclusu in u stessu materiale.Tramindui i trattamenti è i cuntrolli anu da avè paràmetri replicati (minimu trè) di u genu di destinazione è u genu di riferimentu internu.

Ripetizione tecnica
Pigliate u pimentu trattatu cù pesticidi com'è un esempiu di novu.Per u gruppu sperimentale di a pianta A, avemu fattu trè buchi di PCR di 1, 2 è 3 per u so gene di destinazione è u genu di riferimentu internu rispettivamente, per piglià a media dopu a rilevazione.Per u cuntrollu di a pianta A Gruppi sò ancu trattati in u listessu modu.In listessu modu, fate u listessu trattamentu per e piante B è C.Questa hè a ripetizione tecnica.

Vale a pena nutà chìciò chì entra in a statistiche hè a repetizione biologica, è a ripetizione tecnica hè di pruvà s'ellu ci sò fenomeni aleatorii in u prucessu spirimintali, per fà credibili i risultati spirimintali, vale à dì per evità l'errori pigliendu u so mediu cum'è spessu dicemu.

Cuntrolli negativi - NTC è NRT
NTC (Controllu senza Template), un cuntrollu senza un mudellu, hè utilizatu per verificà se u materiale sperimentale hè contaminatu.In generale, l'acqua hè usata cum'è mudellu.Se ci hè una reazione fluorescente, indica chì a contaminazione di l'acidu nucleicu hè accaduta in u laboratoriu.

Queste contaminazioni venenu da: acqua impura, reagenti senza qualificazione chì cuntenenu DNA endogenu, contaminazione di primer, contaminazione di l'equipaggiu di laboratoriu, contaminazione di l'aerosol, etc., bisognu di utilizà RNase scavengers è RNase inhibitors.A contaminazione aerosol hè a più difficiuli di truvà.Imagine chì u vostru laboratoriu hè cum'è smog, cù diversi acidi nucleici sospesi in l'aria.

NRT (senza trascrittasi inversa), u cuntrollu senza trascrizzione inversa, hè u RNA trascrittu micca inversu cum'è un cuntrollu negativu, chì hè u cuntrollu di u residu di gDNA.

Quandu si faci l'espressione genica, a quantità di RNA hè rilevata da a rilevazione di a quantità di cDNA dopu a trascrizione inversa.Se ci hè un residuu di gDNA quandu l'RNA hè purificatu, pruvucarà errori in i risultati sperimentali, perchè i risultati ottenuti sò gDNA è cDNA.À u livellu aggregatu, micca solu cDNA, gDNA deve esse eliminatu completamente durante l'estrazione di RNA.

MIQE (2) - infurmazione di mostra
L'infurmazione di mostra chjamata significa chì quandu publichemu un articulu nantu à qPCR, avemu da spiegà l'infurmazione di mostra chjaramente, chì hè una parte indispensabile di l'articulu.In listessu modu, quandu prucessamu i campioni, duvemu ancu regulà e nostre operazioni per assicurà a validità di i campioni.

A descrizzione di a mostra hè solu un risultatu, è duvemu prestu più attente à i materiali pigliati durante l'esperimentu tutale.

Selezzione di materiali spirimintali
Mostre di sangue - sceglite sangue frescu, micca più di 4 ore.Campioni di cellule - sceglite di cullà e cellule fresche in un periodu di crescita vigorosa.Animal Tissue - Sceglite un tissutu frescu, chì cresce vigorosamente.Plant Tissue - Sceglite un tissutu frescu è ghjovanu.

Avete bisognu chì ci hè una parolla chjave in questi pochi frasi : frescu .
Per i campioni sopra, u kit megliu, costu-efficace è stabile nantu à u mercatu hè u kit di Foregene, chì pò estrae rapidamente è facilmente u so DNA è RNA.

Mini kit di DNA di sangue

Kit d'isolement d'ARN total cellulaire

Kit d'isolazione di l'RNA tutale di l'animali

Kit d'isolazione di l'ARN totali di a pianta

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Kit d'isolazione di DNA di a pianta

Stoccaggio di materiali sperimentali
In generale, ùn ricumandemu micca di almacenà campioni, se e cundizioni permettenu.In ogni casu, ci sò parechji amichi chì ùn ponu micca fà esperimenti immediatamente dopu à u campionamentu, è alcuni anu ancu bisognu di portà i tanki di nitrogenu liquidu à u campu per u campionamentu.

Per stu tipu d'amicu di travagliu duru, possu dì solu chì ùn capisce micca i consumabili reagenti.Avà parechje cumpagnie di consumabili di reagenti pruducenu reagenti chì ponu almacenà campioni di RNA à a temperatura di l'ambienti, è pudete sceglie di usà.U metudu di almacenamentu cunvinziunali hè u almacenamentu di nitrogenu liquidu, utilizendu un picculu tank di nitrogenu liquidu chì hè faciule da trasportà.Dopu avè purtatu a mostra in u laboratoriu, guardala in un frigorifico -80 ° C.

Per esperimenti chì implicanu RNA, u principiu di sei parolle deve esse seguitu:bassa temperatura, senza enzimi,èprestu .

U cuncettu di bassa temperatura hè faciule da capisce;senza enzimi, RNase hè in ogni locu in u mondu chì vivemu in (altrimenti avete statu uccisu da HIV), cusì cumu per evitari RNase quandu facia esperimenti hè un cuncettu assai impurtante;prestu,Ùn ci hè micca Kung Fu in u mondu chì ùn pò micca esse rottu, solu a velocità ùn pò esse rotta.

Dunque, in un certu sensu, u più brevi u tempu di estrazione, u megliu u kit.PerchèForegeneU kit enfatiza a velocità, perchè a cunnosci bè.

PS: Certi fimmineddi facenu esperimenti cù assai cura, ma ùn sò micca boni cum'è un slam dunk dopu parechji anni di travagliu.Si sentenu chì Diu hè ingiustu, si lamenta di l'altri, è cercanu a vita.In fatti, ùn hà micca capitu.Ùn hà micca prutettu bè l'RNA, è u ghjucatore di slam dunk era agile.Quandu facia l'esperimentu, hà pensatu chì finisce u slam dunk cù trè volte, cinque volte è duie divisioni, ma hà fattu l'esperimentu bè.

Nota: Più lento, più probabilità di invasione di RNase.Cumu furmà sè stessu per esse veloce?Ùn ci hè manera, basta à praticà più.

Per diversi esperimenti è diversi campioni, hè sempre necessariu di leghje più letteratura è sceglie un metudu adattatu per u processu.Per u prucessu di cullizzioni di mostra è di almacenamentu, MIQE deve esse chjaramente scrittu in a carta, in modu chì i revisori ponu riviseghjà l'affidabilità di a carta, è hè ancu cunvenutu per i ghjovani stunati per ripetiri u vostru esperimentu.

Ancu l'esperimenti biologichi sò difficiuli, sò high-end.Se ùn site micca attentu, pudete turnà u mondu.Per esempiu, fà SARS in una crisa biochimica, o fà u risu hibridu per salvà 1,3 miliardi di persone.A stampa quì sottu hè un esperimentu chimicu, duvete capisce quantu fieru di a vostra ricerca solu fighjendu u so aspettu di cazzo.Scurdate, ùn lu neru.

MIQE (3) - estrazione di l'acidu nucleicu.
L'estrazione di l'acidu nucleicu hè un grande avvenimentu, è tutti l'esperimenti di biologia moleculare cumincianu cù l'estrazione di l'acidu nucleicu.Prima di tuttu, copiemu u cuntenutu di MIQE nantu à l'estrazione di l'acidu nucleicu.

Fighjendu sta forma, ùn pudete micca stà nantu à a superficia.A forma hè un dogma.Per esse un studiente superiore, duvete dumandà perchè.U cuntenutu essenziale di sta tavula hè: Perseguitepurezza, integrità, consistenza è quantità di estrazione di RNA .

A prima parte di uprucessu o strumentu hè u passu di estrazzioni di l'acidu nucleicu.Se aduprate un extractor automaticu di l'acidu nucleicu per estrarre (avanzatu, per piacè cuntattatemi per a compra), avete bisognu di indicà u nome di u mudellu di l'instrumentu.

U nome di u kit è

chì kit hè stata utilizata per i dettagli di u cambiamentu, chì reagenti speciali sò stati aghjunti o chì operazioni speciali sò state fatte deve esse spiegatu chjaramente per chì l'altri ponu facilmente ripetiri u vostru esperimentu.

Certi pirsuni aghjunghjenu alcuni reagenti speciali quandu estragghjenu campioni speciali, pensendu chì questu hè a so arma secreta è ùn dicenu micca à l'altri.Mantene u sicretu, perdenu ancu l'uppurtunità di fà brilla u vostru articulu.Ùn esse intelligente, avete da esse più onestu chè u paese anticu Zhang in a ricerca scientifica, se vulete esse intelligente, l'articulu vi farà stupidu.

deve ricurdà u numeru di produttu di u kitquandu urdinate u kit è scrive l'articulu.Ci sò generalmente dui numeri nantu à u kit: Cat-numeru di catalogu (numeru di produttu, numeru d'articulu), Lot-numeru di lottu di produttu (Usatu per indicà da quale batch hè vinutu u pruduttu).

Inoltre, u numeru CAS hè spessu utilizatu quandu urdinate reagenti biochimichi, è l'aghju popularisatu inseme.U numeru CAS hè u numeru datu da a Società Chimica Americana à ogni nova droga chimica.In generale, trè numeri sò cunnessi da un trattino.U numeru CAS di Rushui: 7732-18-5.I chimichi spessu anu parechje alias, ma u numeru CAS hè unicu.Quandu ordene a medicina, pudete cuntrollà u so numeru CAS prima.

Più vicinu à a casa, perchè avemu da discriverà queste cose chjaramente?In fatti, hè ancu di verificà a qualità di l'estrazione di RNA.L'usu di strumenti è kit farà l'estrazione di RNA più consistente.A scala d'estrazione di i laboratorii ordinali ùn hè micca grande, è pò esse acquistatu cù kits.

I dettagli di u trattamentu DNase o RNase
L'impurtante prublema di a PCR quantitativa fluorescente hè di prevene a contaminazione di l'ADN, è ùn sperimentate micca s'ellu ci hè contaminazione.Dunque, hè imperativu di dichjarà u prucessu chì avete utilizatu per processà l'ADN, per dimustrà chì l'ADN in u prucessu sperimentale hè statu eliminatu cumplettamente è cumpletamente.rapprisintatu da un schema schematicu.

Schema schematicu di RNA è DNA
In generale, u metudu per sguassà l'ADN hè di trattà RNA cù DNase dopu l'estrazione.Tuttavia, questi sò metudi relativamente antichi.I kit di estrazione di RNA cummirciali sò stati capaci di caccià l'ADN durante u prucessu di estrazione senza aghjunghje DNase.Per esempiu, una seria di kits da Foregene.

Nota: L'eliminazione di l'ADN durante l'estrazione di RNA hè una spada à doppiu tagliu assai periculosa, chì prolongerà u tempu di operazione di l'estrazione di RNA è aumenta u risicu di degradazione di RNA.In fondu, hè un scambiu trà u rendiment di l'RNA è a purezza.

Inoltre, a quantità di DNase aghjuntu à a colonna di adsorption basatu in silice hè assai chjuca, è a DNase d'alta qualità deve esse usata per ottene l'effettu.DNase Unoptimized ùn pò micca esse digeritu rapidamente è cumpletamente.Questa hè una prova di u livellu tecnicu di u mercante.Di sicuru, ci sò ancu più cummircianti strani chì vantanu chì l'ADN pò esse eliminatu senza DNase.Pò esse dettu chì quellu chì si vanta chì l'ADN pò esse eliminatu cumplettamente senza DNase hè un hooligan.L'ADN hè una struttura a doppia fila relativamente stabile, è ùn pò esse sguassata solu parlendu è ridendu.

Valutazione di a contaminazione
metudu di valutazione: rilevazione elettroforesi, 1% agarose, 6V/cm, 15min, carica 1-3 ul

Analisi quantitativa di l'acidu nucleicu
hè generalmente misurata cù un spettrofotometru UV.Lasciami prima popularizà u significatu di i trè valori di OD260, OD280 è OD230.
·OD260nm: Hè a lunghezza d'onda di assorbimentu di u piccu di assorbimentu più altu di l'acidu nucleicu, è u megliu valore misuratu varia da 0,1 à 1,0.Se no, diluite o cuncentrate a mostra per portà in u range.
·OD280nm: Hè a lunghezza d'onda di assorbimentu di u più altu piccu di assorbimentu di proteine ​​​​è sustanzi fenolichi.
·OD230nm: Hè a lunghezza d'onda di assorbimentu di u più altu piccu di assorbimentu di carbuidrati.

Dopu, parlemu di u rolu di ogni indicatore.Per A260, pò esse usatu per misurà u rendiment di l'acidu nucleicu.Quandu OD260 = 1, dsDNA = 50μg/ml, ssDNA = 37μg/ml, RNA = 40μg/ml.

Per a purità, avemu bisognu di guardà i rapporti chì vedemu cumunimenti: OD260/280 è OD260/230.
· DNA puro: OD260/280 hè apprussimatamente uguale à 1,8.Quandu hè più grande di 1,9, indica chì ci hè una contaminazione di RNA, è quandu hè menu di 1,6, indica chì ci hè una contaminazione di proteini è fenoli.
· RNA puru: 1,7
·OD260/230: Ch'ella sia DNA o RNA, u valore di riferimentu hè 2,5.Quandu hè menu di 2,0, indica chì ci hè a contaminazione di zuccaru, sali è materia urganica.

integrità di RNA

Hè assai impurtante per misurà l'integrità di RNA.In generale, hè necessariu di fà un esperimentu di gel di denaturazione di RNA per verificà se a luminosità trà 28S è 18S RNA hè una relazione doppia.Quandu a terza banda 5S appare, significa chì l'RNA hà cuminciatu à degradà, fora di l'invertebrati.

Dati per a valutazione di a qualità di l'RNA: In più di e teste di sopra, ci sò ancu teste di strumenti più avanzati in quantu à l'integrità di l'RNA, cum'è a prova di integrità RQI di u sistema di elettroforesi automaticu Experion, chì pò detectà se l'RNA hè degradatu invisibilmente.

In a ricerca scientifica, a PCR quantitativa fluorescente hè una comparazione trà u genu di destinazione è u genu di riferimentu internu.Dunque, in u prucessu di preservazione di campioni di RNA, estrazione di RNA, etc., u scopu primariu hè di assicurà l'integrità di l'RNA.

Cumu l'integrità di l'RNA affetta l'equilibriu trà u genu di destinazione è u genu di riferimentu internu pò esse facilmente capitu da a figura sottu.A degradazione portarà à l'incompletezza di u genu, sia l'incompletezza di u genu di riferimentu internu sia l'incompletezza di u genu di destinazione, avarà un grande impattu nantu à e dati.

Diagramma schematicu di u genu di destinazione è u genu di riferimentu, ùn deve micca esse veru

Test d'inhibizione (sia chì u valore CT hè soppresso in alta o bassa cuncentrazione o altre cundizioni)

Pigliendu sta figura cum'è un esempiu, i valori Ct di e cinque curve sò i seguenti.A distribuzione di i valori CT trà e curve hè irregulare, è i valori Ct sò ritardati sottu cuncentrazione alta è bassa, chì hè u casu di l'inibizione di PCR.

Puntu chjave: In u prucessu di l'estrazione di l'RNA, avemu bisognu di abbandunà e idee sbagliate è stabiliscenu curretti.

L'idea sbagliata hè: l'estrazione di RNA persegue solu u rendiment, pensendu chì più grande hè a quantità di RNA ottenuta, u megliu.In fatti, quandu facemu a quantificazione, se u numeru di geni ùn hè micca assai grande, ùn avemu micca bisognu di assai RNA.A quantità di RNA chì estrae hè più chè abbastanza.

U cuncettu currettu hè:L'estrazione di RNA deve perseguite a purità, l'integrità è a coerenza.A purità pò assicurà chì a trascrizzione inversa sussegwente ùn hè micca impedita è e dati ùn saranu micca affettati da l'ADN.L'integrità assicura l'equilibriu di sequenze di destinazione è riferimenti interni.A cunsistenza assicura una carica stabile di mostra.

MIQE (4) - trascrizzione inversa
Misconception: a ricerca di u voluminu di mostra più altu.
Cuncepimentu currettu: Perseguite a coerenza (stabilità), indipendentemente da a quantità di RNA caricata, l'efficienza di a trascrizione inversa resta coherente, assicurendu chì e differenze in cDNA ponu veramente riflette differenzi in mRNA.
Spieghemu stu prucessu cù un schema schematicu:

Diagramma schematicu di l'efficienza di a trascrizione inversa, ùn hè micca veru
Prima di tuttu, avemu bisognu di capiscenu a diffarenza trà u prucessu di trascrizione inversa è u prucessu di PCR.A PCR hè sottumessu à parechji prucessi di riscaldamentu è annealing, è u fragmentu di destinazione cresce in modu esponenziale;mentre chì a trascrizione inversa ùn hà micca stu prucessu, pudemu imaginà chì a trascrizzione inversa hè in realtà unu à unu Durante u prucessu di replicazione, tanti pezzi di RNA

cum'è ci sò ponu ottene tanti pezzi di cDNA Information, si deve esse capitu da avà, perchè i frammenti grande è chjuca sò stati reverse-trascrittu, è hè impussibile di fucalizza nantu à un fragmentu.È perchè a quantità di RNA hè relativamente chjuca, a quantità di cDNA ottenuta hè ancu relativamente chjuca, à u cuntrariu di a PCR, chì hà un effettu di amplificazione, per quessa hè basicamente impussibile di detect.

I risultati di l'elettroforesi di cDNA
Siconda, idealmente, a trascrizione inversa hè realizata unu à unu, ma nisuna transcriptase inversa da alcuna cumpagnia pò ottene stu effettu.In fondu, l'efficienza di a maiò parte di e transcriptasi inverse vaga trà 30-50%.Se questu hè u casu, preferimu avè una efficienza di trascrizione inversa relativamente stabile, chì hè ciò chì vulemu vede in a figura: 3 RNA ricevenu 2 cDNAs, 6 RNAs ricevenu 4 cDNAs, cusì ùn importa quant'è mostra hè caricata, l'efficienza di trascrizione inversa hè relativamente stabile.Ùn vulemu vede a situazione induve l'efficienza di a trascrizione inversa hè inestabile è l'alta cuncentrazione hè inibita.

Allora, cumu per verificà se l'efficienza di a trascrizione inversa hè stabile?U metudu hè assai sèmplice, basta à fà una prova di paragone: unu hè di trascrizzione inversa in cDNA dopu a doppia diluzione di RNA, è l'altru hè di fà a diluzione raddoppiata dopu a trascrizzione inversa in cDNA, è poi fà qPCR per vede a pendenza ottenuta Hè coherente.Cum'è un studiente superiore, duvete capisce in sicondi.Comu mostra quì sottu:

Diluzione di RNA è cDNA per pruvà se l'efficienza di a trascrizione inversa hè stabile
Transcriptase inversa è kit
Cumu a PCR quantitativa fluorescente perfetta pò avè una eccellente transcriptase inversa è kit.A transcriptase inversa hè apprussimatamente divisa in dui tipi secondu a fonte, AMV oM-MLV, è u so rendimentu hè u listessu cum'è quellu chì mostra in a tavula.

Attività RNase H
RNase H hè Ribonuclease H, u nome cinese hè ribonucleasi H, chì hè una endoribonuclease chì pò specificamente hydrolyze RNA in a catena hibrida DNA-RNA.A RNase H ùn pò micca idrolizà i legami fosfodiesteri in DNA o RNA a catena unica o doppia, vale à dì, ùn pò micca digerisce DNA o RNA monofila o doppia.Comu cumunimenti usatu in a sintesi di a seconda fila di cDNA.

Hè una cosa strana.Dicemu chì a transcriptase inversa hà attività RNase H, micca chì a transcriptase inversa cuntene RNase H, è ùn pò esse micca pussibule di separà RNase H da a transcriptase inversa, forse per via di a conformazione di certi gruppi in a transcriptase inversa Questa attività hè causata da a transcriptase inversa.

Dunque, indipendentemente da a più alta efficienza di trascrizione inversa di AMV, a so attività RNase H reduce u rendiment di cDNA.Di sicuru, i pruduttori di reagenti ottimisanu constantemente i so prudutti per eliminà l'attività di RNase H in a transcriptase inversa quant'è pussibule per aumentà u rendiment di cDNA.
Temperature de recuit

Struttura secondaria di l'RNA à diverse temperature
Vede a figura sopra per a struttura secundaria di l'RNA à e diverse temperature, è utilizate l'uttellu in linea mFold per determinà a struttura secundaria di u frammentu di destinazione in cundizzioni di temperatura specifica è cuncentrazione di sali.À 55 ° C, a struttura secundaria di l'RNA hè sempre assai cumplessa, a transcriptase inversa ùn pò micca travaglià, è a struttura secundaria ùn pò esse risolta cumplettamente finu à 65 ° C, mentri a temperatura ottima di AMV è M-MLV hè assai più bassu di sta temperatura.
chì fà ?A struttura secundaria hè l'accoppiamentu cumplementarii di u mudellu stessu, chì porta à una forte cumpetizione trà u primer è a transcriptase inversa è u mudellu, chì risultatu in una seria di prublemi cum'è a bassa E è a poca ripetibilità.

chì fà ?Solu cresce a temperatura di annealing quantu pussibule.

Parechji pruduttori di reagenti migliurà a so transcriptase inversa per mezu di l'ingegneria genetica.Qualchidunu aumentanu a temperatura di reazzione, cum'è Jifan è Aidelai, è alcuni eliminanu u gruppu attivu di l'enzima RNase H per migliurà l'affinità trà l'enzima è u mudellu RNA.L'alta affinità pò sprime in modu competitivu a struttura secundaria è leghjite bè, è ancu migliurà assai l'efficienza di a trascrizione inversa.
Puntu chjave: a trascrizzione inversa hè più impurtante per perseguite a cunsistenza di l'efficienza di a trascrizzione inversa (l'enzimi ùn deve esse micca solu efficace, ma ancu stabile), invece di a quantità di mostra caricata, s'ellu ùn hè micca una PCR quantitativa fluorescente particularmente grande, ùn serà micca pussibule.CDNA multiplici.
Diversi pruduttori anu ancu fattu alcuni sforzi in a ricerca di a coerenza.Per esempiu, a maiò parte di l'imprese anu imballatu a trascrizione inversa cum'è un kit standard per a vendita, chì hè una bona scelta.
Per esempiu, i kit di Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (Premix principale per kit di sintesi di cDNA di prima fila)

MIQE (5) - infurmazione di u genu di destinazione

A figura sopra spiega
1. Se stu genu hè efficace per esperimenti ripetuti pò esse verificatu in generale per esperimenti ripetuti.
2. Gene ID, sapete.
3. Lunghezza di u genu, a durata tutale di u genu di destinazione hè definitu micca prublema.Quandu cuncepisce primers, assicuratevi chì a durata di l'amplicon hè trà 80-200bp per assicurà una efficienza di amplificazione megliu.
4. Sequence Blast paraguni infurmazione, u genu mira ci vole à esse paragunatu in genebank à impedisce amplification non-specific.
5. Presenza di pseudogenes.Un pseudogenu hè una sequenza di DNA simile à un genu normale ma perde a so funzione normale.Spessu esiste in a famiglia multi-gene di eucarioti.Hè generalmente rapprisintatu da ψ.Hè una copia di DNA genomica non funzionale in u genoma chì hè assai simili à a sequenza di codificante di u genu., sò generalmente micca trascritti, è ùn anu micca significatu fisiulogicu chjaru.
6. Posizione di i primers relative à l'esoni è l'introni.In i primi anni, quandu avemu risoltu u prublema di a contaminazione di l'ADN, avemu spessu prestatu attenzione à e pusizioni di primers, exons, è introni, è in generale cunzidirava di cuncepisce primers attraversu introni per evità l'amplificazione di l'ADN.Per piacè vede a figura quì sottu: u neru rapprisenta introni, i varii blu rapprisentanu l'esoni, u rosa rapprisentanu i primers cumuni, è u rossu luminosu rapprisentanu i primers intron-spanning.

Schematicu, mai veru
Chì un pianu perfettu questu pare, ma in fattu, in a maiò parte di i casi, i primi trans-introni ùn sò micca magichi cum'è l'imaginate, è ancu pruvucarà amplificazione non specifica.Allora u megliu modu per prevene a contaminazione di l'ADN hè di sguassà completamente l'ADN.
7. Predizione di cunfurmazioni.Utilizendu questu esempiu di novu, utilizate l'uttellu in linea mFold per determinà a struttura secundaria di u fragmentu di destinazione à una temperatura specifica è cuncentrazione di sali.

Struttura secondaria di l'RNA à diverse temperature
A struttura secundaria hè l'accoppiamentu cumplementarii di u mudellu stessu, chì portarà à una forte cumpetizione trà l'apparizione di u primu è u mudellu, è e chance di ubligatoriu di u primariu sò menu, risultatu in una seria di prublemi cum'è E bassu è pocu ripetibilità.Per mezu di a prediczione di u software, se ùn ci hè micca un prublema di struttura secundaria, questu seria grande.Se ci hè, u nostru articulu di seguitu discuterà specificamente cumu risolve stu prublema.

MIQE (6) - qPCR Oligonucleotides

Per a PCR quantitativa fluorescente, a prima cosa chì luttate cù ogni ghjornu hè l'estrazione di RNA, è a seconda cosa pò esse un disignu di primer.
Prima di tuttu, avemu sempre cuntrollà e regule nantu à u disignu di u primu secondu a lista di verificazione MIQE.Hè cusì simplice chì i scumbags ponu riri, è pudemu finisce in una frase: scopre a sequenza è a pusizione di a sonda di prima è u metudu di mudificazione.Per u metudu di purificazione di u primu, a sintesi di u primu hè cusì prezzu in u mumentu, qPCR hè degne di PAGE è sopra i metudi di purificazione, è l'infurmazioni di u strumentu di sintesi ùn hè micca impurtante.Parechje persone anu fattu primers per decennii è ùn sanu micca chì u sintetizzatore hè ABI3900.
In quantu à i principii di cuncepimentu di u primu, ùn avete micca à memorizà da a memoria, perchè a maiò parte di u software di cuncepimentu di u primu o di l'arnesi in linea pò piglià a cura di questi prublemi (uttenimentu in linea ricumandatu primer3.ut.ee/), è u 99,999% di u disignu di u primu ùn hè micca fattu manualmente.
Basta à verificà i seguenti punti dopu chì i primers sò stati disignati:
1. Primi di cuncepimentu vicinu à l'estremità 3': In u casu di l'usu di oligo dT primers per a sintesi di u primu filu di cDNA, cunsiderendu l'efficienza di trascrizione inversa è l'integrità di l'RNA, i primers designati anu da esse disignati vicinu à l'estremità 3' per migliurà l'efficienza di amplificazione.Aduprate una stampa per spiegà cusì (ùn ci hè micca manera di capisce questu):

Perchè i primers deve esse designatu vicinu à l'estremità 3', ùn deve micca esse veru
2. Valore TM: U valore Tm hè à 55-65 ° C (perchè l'attività exonuclease hè u più altu à 60 ° C), è u cuntenutu GC hè à 40% -60%.
3. BLAST: Per evità l'amplificazione non specifica di u genoma, Blast deve esse usatu per verificazione supplementaria.

MIQE (7) - prucessu qPCR

1. kit qPCR
Sicondu i requisiti di MIQE, duvemu descrive chjaramente e cundizioni di reazione cumpleta in l'articulu, cumprese a cunfigurazione di u sistema di reazione PCR, quale kit hè utilizatu, quale hè u fabricatore, quantu hè grande u sistema di reazione, se u metudu di tintura o u metudu di sonda hè utilizatu, paràmetri di u prugramma PCR.I cunduttori veterani truveranu definitivamente chì, finu à chì u kit hè sceltu, l'infurmazioni sopra sò basamente determinate.
Attualmente, a fabricazione è a produzzione di kits PCR quantitativi fluorescenti hè una tecnulugia assai matura.Sempre chì ùn sceglite micca pruduttori estremamente cattivi, a probabilità di prublemi ùn hè micca alta, ma vulemu ancu sparte cun voi uni pochi di punti:
Enzyme Taq di partenza calda:A parte più impurtante di a PCR hè l'enzima Taq hot-start.L'enzimi hot-start in u mercatu sò generalmente divisi in dui tipi, unu hè un enzima hot-start modificatu chimicamente (pudete imaginà cum'è paraffina incrustazione), è l'altru hè un enzima hot-start per a mudificazione di anticorpi (antigen-antibody binding).A mudificazione chimica hè un modu iniziale di l'enzimi di partenza calda.Quandu una certa temperatura hè righjunta, l'enzima liberarà a so attività.L'enzima hot-start modificata da l'anticorpu usa metudi biologichi per bluccà l'attività di l'enzima.Quandu una certa temperatura hè ghjunta, l'anticorpu serà denaturatu è inattivatu cum'è una proteina, è l'attività enzimatica serà purtata in ghjocu.

Tuttavia, chì hè l'usu di questu?Questu hè u casu, l'attività di liberazione di l'enzimi mudificati da l'anticorpu hè più veloce di quellu di l'enzimi mudificati chimicamente, cusì in quantu à a sensibilità, l'enzimi mudificati cù l'anticorpi anu un ligeru vantaghju, cusì chì ùn ci sò basicamente micca enzimi mudificati chimicamente in i kit in u mercatu.S'ellu ci hè, allora a tecnulugia di stu fabricatore hè sempre in l'era di u millenniu.
Cuncentrazione di ioni di magnesiu:A cuncentrazione di ioni di magnesiu hè assai impurtante in a reazione PCR.A cuncentrazione di ioni di magnesiu adattatu pò prumove a liberazione di l'attività enzyme Taq.Se a cuncentrazione hè troppu bassu, l'attività di l'enzima serà significativamente ridutta;se a cuncentrazione hè troppu alta, l'amplificazione non specifica catalizzata da l'enzima serà rinfurzata.A cuncentrazione di ioni di magnesiu affetterà ancu l'anneling di primers, a temperatura di fusione di u mudellu è i prudutti di PCR, affettendu cusì u rendiment di frammenti amplificati.A cuncentrazione di ioni di magnesiu hè generalmente cuntrullata à 25mM.Di sicuru, per un bonu kit, a cuncentrazione di ioni di magnesiu deve esse bè cuntrullata.Certi cummircianti aghjunghjenu un agenti chelante di magnesiu à u reattivu, chì ponu ottene l'effettu di l'ajustamentu automaticu di a cuncentrazione di ioni di magnesiu.
Concentrazione di tintura fluorescente:U colorante fluorescente, chì hè u SYBR Green chì usualmente usemu, genera principalmente fluorescenza liendu à u solco minore di DNA a doppia filatura, perchè u ligame di a tintura à l'ADN doppia filamentu ùn hè micca specificu, vale à dì, finu à chì l'ADN doppia filamentu hè cumminatu cù questu, a fluorescenza pò accade, cusì primer-dimeri è un segnali di DNA combinanu in u sistema.
PS: Per via di e so proprietà sensibili à a luce, i prudutti nantu à u mercatu sò generalmente imballati in tubi centrifugati opachi marroni (cum'è mostra in a stampa sottu).Tuttavia, questu scuntrà un prublema.Hè difficiuli di vede s'ellu u liquidu hè succhiatu durante u campionamentu.In questu rispettu, Qingke hè veramente u più user-friendly (cum'è mostra in a stampa sottu), è u tubu trasparente hè imballatu in un saccu di stagno opaca.Allora mette in un saccu di stagno, tenendu in contu a cunvenzione di evità a luce è a mostra.Duvete sceglie u numeru di produttu ghjustu.TSE204 hè una esistenza super-costu-efficace, chì mi fa vulete plantà erba.

A cuncentrazione di u tintu fluoriscente hè ancu assai impurtante.Se a cuncentrazione hè troppu bassu, a curva di amplificazione ùn cullà micca in u stadiu più tardi è ùn hè micca perfetta;se a cuncentrazione hè troppu alta, pruvucarà interferenza di rumore.Siccomu a PCR quantitativa fluorescente dipende principalmente da u valore CT, se a cuncentrazione di u tintu fluoriscente ùn hè micca adattatu bè, u puntu bassu hè megliu cà u puntu altu.Di sicuru, a cuncentrazione di tintura adatta hè u megliu.

ROX: I tinti ROX sò usati per correggerà l'errori di signali di fluorescenza bè à bè.Certi pruduttori di strumenti necessitanu calibrazione, mentre chì altri ùn anu micca.Per esempiu, l'usu di l'instrumentu d'amplificazione PCR in Tempu Reale di Thermo Fisher Scientific richiede di solitu calibrazione, cumprese 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc. L'istruzzioni di u kit generale u descriverà.
qPCR Mix di Foregene cuntene ancu tintura ROX, chì hè cunvenuta per l'usu in parechji mudelli.

Real Time PCR Kit-Taqman

Trattamentu di ligami d'idrogenu debule: U trattamentu di ligami d'idrogenu debbuli hè una materia relativamente tecnica.Nunda hà lettu i manuali di parechji kit, ma nimu d'elli hà mintuatu stu tema.In fatti, hè cusì impurtante.A cumminazzioni di basi dipende principalmente da a forza di ligami d'idrogenu.I ligami d'idrogenu forti sò l'amplificazione normale, è i ligami d'idrogenu debuli portanu à l'amplificazione non specifica.Se i ligami d'idrogenu debuli ùn ponu esse eliminati bè, l'amplificazione non specifica ùn pò esse evitata.In u scopu di l'autore, solu uni pochi di cumpagnie anu nutatu stu prublema.Quandu avete cumprà u kit, pudete riferite s'ellu avete cunsideratu una suluzione in questu sensu per u kit chì vulete sceglie.

Volume di reazione: U sistema 20-50ul hè più comunmente utilizatu, è i volumi più chjuchi sò prubabile di causà errori.In generale, l'istruzzioni di u kit ricumanderanu l'usu di volumi di reazione PCR.Ùn siate micca intelligenti è utilizate volumi più chjuchi per risparmià i costi.u scopu di.U voluminu ricumandatu da i cummircianti hè statu veramente pruvatu, è pò esse chì ùn ponu micca risolve u prublema di l'errori causati da picculi volumi.
2. U fabricatore è u numeru di l'articulu di u piattu tubu
Tuttu u mondu cunnosce u principiu di a PCR quantitativa fluorescente.A cullizzioni di fluorescenza hè principalmente realizata attraversu tappi di tubi PCR.Quandu sceglite i consumabili PCR, fate attenzione à dui punti: una bona trasmissione di luce è adattata per u strumentu.In generale, i tavulini è i tubi di e marche mainstream sò bè, ma avete a sceglie cun cura in termini di adattazione, altri ùn puderete micca aduprà u strumentu.

4. Cunniscenza di u livellu superiore

MIQE (8) - validazione qPCR
Questa hè a prima priorità di qPCR!Tanti eroi sò cascati in a sabbia quì.Di sicuru, hè ancu pussibule chì site furtunatu è i genesi chì avete studiatu sò simplici, cusì flottate à traversu a caverna di ghiaccio longu u ventu.L'infurmazione di verificazione di qPCR hè destinata à pruvà l'affidabilità di e dati.Elenchimu l'infurmazione di verificazione necessaria cum'è seguente:

1.Test di specificità
A specificità di l'amplificazione di u genu di destinazione hè pruvata da cuntrollà se a stampa di l'elettroforesi hè una sola banda;verificazione di sequenza;curva di fusione per vede s'ellu a mappa di u piccu hè unicu;verificazione di digestioni enzyme è altri metudi.
Quì, avemu focu annantu à tL'analisi di l'amplificazione non specifica utilizendu u metudu di curve di fusione.In generale, quandu cuncepemu primers, a dimensione di u frammentu di u produttu deve esse in a gamma di 80-200bp, chì face a temperatura di fusione di u pruduttu PCR 80-85 ° C.Per quessa, s'ellu ci sò picchi miscellaneous, ci deve esse altri prudutti di amplificazione non specifichi;se u piccu pare sottu à 80 ° C, hè generalmente cunsideratu cum'è un dimeru di prima;s'è u piccu pare sopra à 85 ° C, hè generalmente cunzidiratu à esse contamination DNA o più Nonspecific amplification di grande frammenti.
Nota: A volte ci hè solu un piccu à 80 ° C.À questu tempu, stu cuncettu deve esse rispettatu.Hè prubabile chì i risultati di l'amplificazione sò tutti dimeri di primer.

Curva di fusione normale (piccu unicu senza amplificazione micca specifica)

Curva di fusione problematica (amplificazione non specifica di picchi spuri)
【Analisi di casu】

Ci hè un piccu principale, ma u primu dimeru hè seriu
A curva di fusione di u piccu unicu in a figura sottu pò facilmente ingannà i vostri ochji, pensendu chì hè un esperimentu perfettu, ma u risultatu hè completamente sbagliatu.À questu tempu, avemu da guardà a temperatura di fusione.A temperatura massima hè sottu à 80 ° C, chì hè cumpletamente primer-dimer.

Nisun frammentu di destinazione, tutti i dimeri di primer
Quì, u mo fratellu ùn si pò piantà.A stampa sottu hè una foto presa cù un telefuninu mandatu à mè da un scumbag.I reagenti chì hà utilizatu sò tutti i marchi cumunimenti usati in l'industria.Hà cambiatu da una marca T-prefix à una altra marca T-prefix.Pensu chì l'avete digià indovinatu.U scumbag mi chianciava: "U reagentu utilizatu in a prima stampa hè troppu bonu, è u piccu hè unicu.In seguitu, dopu avè utilizatu u reattivu chì avete cunsigliatu, diventa cum'è a seconda stampa, cù picchi misti.M'avete fattu miserable."
Separate i dui grafici.À u primu sguardu, unu hà un piccu unicu, è l'altru hà un piccu doppiu.Sciocca, una sola cima hè di sicuru bè.Hè veru?
Peggiu di Dou E, s'e aghju messu i dui ritratti in u ritrattu sottu, vi capisce subitu.In fatti, semu facilmente paralizati da stu tipu di stampa.Dopu un analisi attentu, truvamu chì: u piccu di a prima figura hè à 75 ° C, chì hè cumpletamente primer dimer;u piccu di a seconda figura si prisenta à 75 ° C è 82 ° C, almenu ci sò U pruduttu appare.

Ritratti di feedback da i studienti
Allora u prublema fundamentale ùn hè micca u prublema di i reagenti, ma u prublema di u primu disignu.À u listessu tempu, prova ancu chì certi grandi marche ùn sò micca di qualità di ferru, è ancu prova ciò chì u mo fratellu hà dettu prima: Ùn hè micca a marca di reagenti chì sustene u vostru articulu.Hè u vostru articulu chì sustene a marca di reagenti.Immaginate, se u scumbag ùn hà micca cambiatu i reagenti, i dati sbagliati seranu mandati à u ghjurnale, è ciò chì succede seria una tragedia.
2. Ct valore di cuntrollu in biancu
Ùn spiegà micca, se u cuntrollu in biancu hà un valore Ct, ùn hè micca a contaminazione ?Tuttavia, avete sempre bisognu di capisce quale cuntrollu in biancu hà un valore Ct.S'ellu hè NTC, significa chì ci hè DNA straneru cum'è a contaminazione di reagenti.S'ellu hè NRT, significa chì l'RNA estratto hà contaminazione di DNA.
3. Curve standard
Cumprendu a pendenza è a formula di calculu, l'efficienza PCR pò esse calculata per mezu di a formula.Un esperimentu perfettu richiede a pendenza di a curva standard per avvicinà 3,32, è R² per avvicinà 0,9999.
4. Gamma dinamica lineale
A gamma dinamica di a reazione hè lineare.Sicondu u mudellu utilizatu per generà a curva standard, a gamma dinamica deve include almenu 5 gradienti di cuncentrazione, è attente à u cambiamentu di i valori Ct à gradienti di cuncentrazione alta è gradienti di cuncentrazione bassa.
5. Precisione di rilevazione
I cambiamenti in i risultati di qPCR, vale à dì una poca ripetibilità, vale à dì una poca precisione, sò causati da parechji fatturi, cumprese a temperatura, a cuncentrazione è u funziunamentu.A precisione di qPCR diventa generalmente menu cuntrullabile cum'è u numeru di copie diminuisce.Ideale in a variazione sperimentale, sta variazione tecnica deve esse distinta da a variazione biologica, è i replicati biologichi ponu direttamente indirizzà e differenze statistiche in i risultati qPCR trà gruppi o trattamenti.In particulare per i saggi diagnostichi, a megliu precisione inter-assay (ripetibilità) in i siti è l'operatori deve esse rappurtata.
6. Efficienza di rilevazione è LOD (in multiplex qPCR)
LOD hè a cuncentrazione più bassa di 95% di i campioni pusitivi rilevati.In altre parolle, a cuncentrazione di LOD cuntenuta in un inseme di replicati di geni di destinazione ùn deve esse più di u 5% di e reazzioni falluti.Quandu fate l'analisi qPCR multiplex, in particulare per a rilevazione simultanea di mutazioni puntuali o polimorfismi, qPCR multiplex hà bisognu di furnisce evidenza chì l'accuratezza di parechji frammenti di destinazione ùn hè micca cumprumessa in u stessu tubu, a rilevazione multipla è a rilevazione di un tubu unicu Efficiency è LOD deve esse uguali.In particulare quandu i geni di destinazione d'alta concentrazione è i geni di destinazione di cuncentrazione bassa sò simultaneamente amplificati, stu prublema deve esse attentu.
Prublemi è suluzioneIn generale, i prublemi spessu scontri in qPCR debugging focus nantu à i seguenti aspetti:
· amplificazione non specifica
· Difficile scelta di cuncentrazione di primer è prublemi cù primer-dimers
·A temperatura di annealing hè imprecisa
· A struttura secundaria afecta l'efficienza di amplificazione
amplificazione non specifica
amplificazione non specificaaccade , hè generalmente cunsideratu se u disignu di prima ùn hè micca adattatu, ma s'ellu ùn site micca in furia per cambià i primeri, pudete pruvà i seguenti metudi prima (u principiu hè ancu attaccatu):
· Aumentà a temperatura di l'anneling - pruvate à fà ligami d'idrogenu debbuli incapaci di mantene;
·Shorten annealing and elongation time - reduce the chance of debbuli ligami d'idrogenu;
· Reduce a concentrazione di primer - riduce a probabilità di ubligatoriu di primers redundant è regioni non target;
Bassa efficienza di amplificazione
A situazione opposta à l'amplificazione non specifica - efficienza di amplificazione bassa, è e misure per trattà cun efficienza di amplificazione bassa sò ghjustu u cuntrariu:
·Prolonga u tempu di annealing è allungamentu;
· Cambia a PCR in trè tappe è riduce a temperatura di annealing;
· Aumentà a cuncentrazione di primer;
Ps: Parechji studienti graduati nati in l'anni 90 ùn sò micca disposti à studià cumu debug esperimenti, è speranu chì u kit pò risolve cumplettamente u prublema (se vulete andà in una cumpagnia di reagenti per fà ricerca è sviluppu dopu a graduazione), in fatti, i pruduttori di reagenti pensanu ancu cusì cusì, spergu chì sia un stupidu Pò esse usatu quandu avete, cusì i pruduttori di reagenti anu spesu assai prublemu di amplificazione, cumpresu un pocu di sforzu. fattori di assorbimentu di ligami.Per risolve facilmente u prublema, i stupidi anu sempre à leghje l'intruduzioni di a cumpagnia di reagenti per vede s'ellu ci hè un fattore chì assorbe ligami d'idrogenu debbuli.
Scelta difficiuli di cuncentrazione di primer è prublemi cù primer-dimers
Metudu 1: In generale, l'istruzzioni di u kit per qPCR anu sistemi cunsigliati è cuncentrazioni di primer.
Metudu 2: Debugging impostando u gradiente di cuncentrazione di primer.A stampa sottu hè arrubbata da una cumpagnia per illustrà.A figura sottu mostra i risultati quantitativi di fluorescenza fatta cù trè gradienti di cuncentrazione di primer (100nM, 250nM, 500nM) è quattru gradienti di cuncentrazione di mudelli (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).U valore Ct di i risultati spirimintali hè tracciatu cusì:

Selezione di a Concentrazione di Primer Concatenate ogni cuncentrazione di primer in una linea cusì:

L'scelta di a cuncentrazione di primer hè ovvia, a relazione lineale di a cuncentrazione di prima di 100nM è 250nM hè megliu, è a relazione lineale di a cuncentrazione di primer di 500nM hè relativamente povera.In 100nM è 250nM, u valore Ct di 250nM hè relativamente chjucu, cusì a cuncentrazione ottima di primer hè 250nM.In generale, severi primer-dimers ponu esse vistu in a curva di fusione.E se i primers cuncepiti ùn ponu micca evitari i primer-dimeri?
Metudu 3: Reduce a quantità di primers è aumenta a temperatura di annealing (ùn hè bisognu di spiegà).
U valore empiricu di a temperatura di annealing hè 60 ° C.Se ùn site micca sicuru, cumu selezziunate una temperatura di annealing più adatta?A risposta hè listessa cum'è l'scelta di cuncentrazione di primer -prova di gradiente.Pigliate una foto da a cumpagnia Bio-rad per illustrà u prublema.Per l'amplificazione di un certu fragmentu di destinazione, stabilisce ottu gradienti di temperatura, ognunu cù trè ripetizioni, è a curva di amplificazione ottenuta hè a siguenti:

Scelta di temperatura di ricottura:
·70 ° C, 69 ° C - In fondu, i primers ùn ponu esse cumminati, perchè ùn ci hè micca amplificazione.
·67,3 ° C - Ci hè una piccula quantità di amplificazione à u principiu, è u valore Ct hè relativamente grande.
·64,5 ° C——U valore Ct diminuisce.
·À 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C, è 55,0 ° C, i valori Ct basamente tendenu à esse stabile, ma i valori di fluoriscenza finali eranu diffirenti.
Comu sceglie ?Principiu: U primu principiu hè u valore Ct più altu.Per u listessu valore Ct, sceglite una temperatura di annealing più altu per evità a dimerizazione è l'amplificazione non specifica.Ancu s'ellu ci hè un valore di fluoriscenza più altu à 55 ° C, pò esse dimeri o amplificazione non specifica in questu.
Ma s'è vo site cusì intelligente cum'è voi, certamente penserete: In modu logicu, se a reazione PCR hè assai specifica, finu à chì a cuncentrazione di primer supera u requisitu minimu, i punti alti è bassi ùn anu micca effettu, cum'è i coloranti fluorescenti è i dNTP.En effet, tant que la température de recuit est bien optimisée, l'effet de la concentration de l'amorce sur la valeur Ct sera naturellement minimisé.

A temperatura di annealing hè ottimisata bè, è l'effettu di a cuncentrazione di primer nantu à CT serà minimizatu
A struttura secundaria afecta l'efficienza di amplificazione
Pigliemu a foto da Bio-rad per illustrà u prublema.Diseghja ancu un gradiente di temperatura per amplificà un genu cù una struttura secundaria.

Emerge una struttura secundaria
Si pò vede chì, cum'è u gradiente di temperatura diminuite, i prudutti cumincianu à cumparisce è u valore Ct avanza, righjunghjendu u valore minimu à 60,7 ° C, è dopu chì u gradiente di temperatura diminuisce, u valore Ct diventa più grande.À u cuntrariu, cum'è a temperatura aumenta, a struttura secundaria si apre è l'efficienza di amplificazione aumenta.Dopu avè righjuntu una certa temperatura, l'aumentu di a temperatura ùn pò micca migliurà l'efficienza di amplificazione.Perchè i primi ùn ponu micca esse cumminati in modu stabile à questu tempu.Dunque,cercate a temperatura cù u valore Ct più bassu, chì hè a megliu temperatura per amplificà u mudellu di struttura secundaria!Di sicuru, i stupidi intelligenti anu da sapè chì s'ellu ùn hè micca necessariu, hè megliu cambià i primi è evitari a regione di a struttura secundaria.
5. Livellu di applicazione
MIQE - Analisi di dati

L'analisi di dati hè principalmente data da u strumentu PCR quantitativa fluorescente.In l'articulu precedente, assai travagliu di analisi di dati hè statu fattu, cum'è u cuntrollu in biancu, chì hè statu spiegatu in u disignu di l'esperimentu.I geni di riferimentu internu, numeri ripetuti, etc. sò stati clarificati., quì spieghemu principalmente l'applicazione di qPCR.
qPCR hè largamente utilizatu, è a verificazione sperimentale è u diagnosticu di l'acidu nucleicu sò i scenarii più cumuni.
quantificazione assoluta
Log (concentrazione iniziale) hà una relazione lineale cù u numeru di ciculi.Una curva standard pò esse tracciata da un standard cun numeru di copia iniziale cunnisciutu, vale à dì, a relazione lineale di a reazione di amplificazione pò esse ottenuta.Sicondu u valore Ct di a mostra, a cuncentrazione in a mostra pò esse calculata.A quantità di mudelli da include.

Metudu di calculu quantità assolutu
A quantificazione assoluta deve esse basatu annantu à a curva standard.Per fà una curva standard, un standard hè necessariu.Di solitu, u standard hè un plasmide ottenutu clonendu u genu di destinazione.Perchè hè un plasmide?Perchè u DNA plasmidi circular hè u più stabile.Dilute u pruduttu standard in 5 à 6 gradienti secondu u rapportu di duppiu (dilution 10-fold), è fate cura à l'uniformità quandu diluting.Chì u valore Ct falà trà 15-30.

Preparazione standard
À u listessu tempu, a mostra per esse pruvata deve ancu esse diluita in cunseguenza (ricurdativi di u fattore di diluzione), è u valore Ct deve ancu falà trà 15-30.U pruduttu standard + a mostra per esse pruvata sò messe nantu à a macchina inseme.Dopu a corsa, una curva standard hè stata fatta cù a sustanza standard, è i campioni per esse pruvati sò stati purtati in a curva standard per calculà a cuncentrazione.
A quantificazione di l'hepatitis B virus HBV hè una quantificazione assoluta tipica, chì pò calculà u numeru di copia di virus in 1ml di sangue.
U calculu di u numeru di copia
Cuncentrazione di u campione da pruvà (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × fattore di diluzione
Sample molecular weight = numeru di basi × ​​324
U numeru di copia di a mostra per esse pruvata (copies / ul) = a cuncentrazione di a mostra per esse pruvata / u pesu moleculare di a mostra × 6 × 1014

Metudu di calculu di u numeru di copia

U sopra hè u metudu di calculu per determinà a quantità.Questu hè un prublema matematicu chì pò esse risoltu dopu a graduazione di u liceu, è i prublemi matematichi sò generalmente risolti da l'urdinatori.Se ùn capite micca, pudete vene à cumunicà.
quantificazione relative
A quantificazione relativa hè principalmente aduprata in a ricerca scientifica.Quantu virus sò in 1ml di sangue, è hè un virus DNA, questu hè un avvenimentu relativamente deterministicu: a quantità di sangue pò esse determinata, è u virus DNA hè relativamente stabile.Tuttavia, hè difficiule per noi di paragunà u numeru di copie di trascrizione di un certu gene in una foglia, perchè hè difficiule di determinà a dimensione, u pesu è a tenerezza di a foglia, a quantità di RNA estratta hè difficiule di determinà, è l'efficienza di a trascrizione inversa hè ancu difficiule di determinà, vale à dì chì ogni passu pò fà chì e dati sperimentali anu bug è ùn ponu micca esse usatu.
Dunque, a quantificazione relativa deve introduci un elementu:u genu di riferimentu internu.
In altri palori, a quantificazione relativa hè in realtà un paragone trà u genu di destinazione è u genu di riferimentu internu.Comparatu in u stessu tissutu è a stessa cellula, l'influenza di a dimensione di mostra, a quantità di estrazione di RNA, l'efficienza di a trascrizione inversa è l'efficienza di a PCR hè relativamente chjuca.A causa di a piccula dimensione di mostra, i geni di riferimentu interni è i geni di destinazione sò stati relativamente ridotti.Hè per quessa chì avemu enfasi di l'uniformità è a stabilità prima.
I geni di riferimentu internu sò generalmentegeni di pulizia(genes di casa), chì si riferiscenu à una classa di geni chì sò spressi stabilmente in tutte e cellule, è i so prudutti sò necessarii per mantene l'attività di vita basica di e cellule.
Ùn cunfundite micca stu cuncettu.I geni di a casa sò termini di funzione biologica, mentri i geni di riferimentu internu sò termini tecnichi sperimentali.I geni di a pulizia anu da passà a validazione prima di pudè esse selezziunati cum'è geni di riferimentu internu.
Per esempiu, avemu sceltu parechji geni di a casa in a figura sottu per pruvà i so livelli di spressione in diverse cellule di tissuti, è truvamu chì i livelli di spressione di β-2-microglobulina eranu assai diffirenti da quelli di l'altri trè geni, perchè ùn puderanu micca esse usatu cum'è geni di riferimentu internu.

Dopu avè capitu a funzione di currezzione di u genu di riferimentu internu, dui algoritmi sò derivati ​​per l'intruduzioni di u genu di riferimentu internu.
· metudu di curva doppia standard
·2 - Metudu △△Ct (metudu di paragone di valori CT)
Sè vo site interessatu à studià e spezie è e funzioni di i geni, per piacè rinunzià à a ricerca nantu à l'algoritmi è aduprà formule direttamente, o aduprà e macchine direttamente;Sè vo site un omu drittu in matematica è ingegneria, sentite liberu.
Metudu di curva doppia standard
Quantificate u genu di destinazione è u genu di a casa di a mostra di cuntrollu è a mostra per esse pruvata attraversu a curva standard, è poi calculate u valore relativo secondu a formula di calculu, chì hè u livellu di espressione relative.
Vantaghji: analisi simplice, ottimisazione sperimentale relativamente simplice
Disadvantage: Per ogni genu, ogni volta di esperimenti deve fà una curva standard
Applicazione: Unu di i dui metudi quantitativi relative più cumuni è ricunnisciuti in u studiu di a regulazione di l'espressione genica.
A formula hè a siguenti:

Esempii sò i seguenti:

Calculate a quantità relativa basatu annantu à u risultatu quantitatiu
2 - Metudu △△Ct (metudu di cunfrontu di valori CT)

Vantaghji: Ùn ci hè bisognu di fà una curva standard
Disadvantages: Si assume chì l'efficienza di amplificazione hè vicinu à 100%;a deviazione standard hè < 5%, è a curva standard è l'efficienza trà ogni amplificazione sò assuciati cunsistenti;l'optimizazione di e cundizioni sperimentali hè più cumplicata.
Applicazione: Unu di i dui metudi quantitativi relative più cumuni è ricunnisciuti in u studiu di a regulazione di l'espressione genica.

Di sicuru, l'efficienza di amplificazione hè di solitu impussibile esse perfettamenti 1. Metudu di currezzione: Se sapemu chì u genu di destinazione è u genu di riferimentu anu a listessa efficienza di amplificazione, ma l'efficienza di amplificazione ùn hè micca uguale à 1, allora 2－△△Ct pò esse currettu cum'è: (1+E)－△△Ct, per esempiu, l'efficienza di amplificazione pò esse curretta, se l'amplificazione pò esse calculata, per esempiu, si pò esse calculatu l'efficienza di amplificazione per esempiu. 1,95－△△Ct
Finu a ora, u cuntenutu di a PCR quantitativa fluorescente hè ghjuntu à a fine.