Nisun signali di amplificazione

1.The Taq DNA Polymerase in u kit perde a so attività per u almacenamentu impropriu o a scadenza di u kit.
Raccomandazione: Cunfirmà e cundizioni di almacenamiento di u kit;aghjunghje una quantità adatta di Taq DNA Polymerase à u sistema PCR o cumprà un novu Kit PCR in Tempu Reale per esperimenti cunnessi.

2.Ci sò assai inhibitori di Taq DNA Polymerase in u mudellu di DNA.
Suggerimentu: Ripurificate u mudellu o riduce a quantità di mudellu utilizatu.

3.A cuncentrazione di Mg2 + ùn hè micca adattatu.
Raccomandazione: A cuncentrazione di Mg2 + di u 2× Real PCR Mix chì furnimu hè 3.5mM.In ogni casu, per certi primers speciali è mudelli, a cuncentrazione di Mg2 + pò esse più altu.Dunque, pudete aghjunghje direttamente MgCl2 per ottimisà a cuncentrazione di Mg2 +.Hè cunsigliatu à cresce u Mg2 + 0.5mM ogni volta per ottimisazione.

4.I cundizioni di amplificazione di PCR ùn sò micca adattati, è a sequenza di prima o cuncentrazione hè impropriu.
Suggerimentu: cunfirmà a correzzione di a sequenza di prima è u primu ùn hè micca degradatu;se u signale di amplificazione ùn hè micca bonu, pruvate à calà a temperatura di annealing è aghjustate a cuncentrazione di prima in modu adattatu.

5.A quantità di mudellu hè troppu pocu o troppu.
Raccomandazione: Eseguite a diluzione di gradiente di linearizazione di u mudellu, è selezziunate a cuncentrazione di u mudellu cù u megliu effettu PCR per l'esperimentu di PCR in Tempu Reale.

NTC hà un valore di fluorescenza troppu altu

1.Contaminazione Reagent causata durante u funziunamentu.
Raccomandazione: Sustituisce cù novi reagenti per esperimenti di PCR in Tempu Reale.

2.Contamination hè accadutu durante a preparazione di u sistema di reazzione PCR.
Raccomandazione: Pigliate e misure protettive necessarie durante l'operazione, cum'è: guanti di lattice, usendu una punta di pipette cù un filtru, etc.

3.The primers sò degradati, è a degradazione di i primers pruvucarà amplificazione non specifica.
Suggerimentu: Aduprate l'elettroforesi SDS-PAGE per detectà se i primers sò degradati, è rimpiazzàli cù novi primers per esperimenti di PCR in Tempu Reale.

Primer dimer o amplificazione non specifica

1.A cuncentrazione Mg2 + ùn hè micca adattatu.
Raccomandazione: A cuncentrazione di Mg2 + di u 2 × Real PCR EasyTM Mix chì furnimu hè 3.5 mM.In ogni casu, per certi primers speciali è mudelli, a cuncentrazione di Mg2 + pò esse più altu.Dunque, pudete aghjunghje direttamente MgCl2 per ottimisà a cuncentrazione di Mg2 +.Hè cunsigliatu à cresce u Mg2 + 0.5mM ogni volta per ottimisazione.

2.The temperatura annealing PCR hè troppu bassu.
Suggerimentu: Aumente a temperatura di recuit PCR di 1 ℃ o 2 ℃ ogni volta.

3.U pruduttu PCR hè troppu longu.
Raccomandazione: A durata di u pruduttu Real Time PCR deve esse trà 100-150bp, micca più di 500bp.

4.I primers sò degradati, è a degradazione di i primers portanu à l'apparizione di amplificazione specifica.
Suggerimentu: Aduprate l'elettroforesi SDS-PAGE per detectà se i primers sò degradati, è rimpiazzàli cù novi primers per esperimenti di PCR in Tempu Reale.

5.U sistema PCR hè impropriu, o u sistema hè troppu chjucu.
Suggerimentu: U sistema di reazzione PCR hè troppu chjucu farà diminuite a precisione di rilevazione.Hè megliu aduprà u sistema di reazzione cunsigliatu da l'instrumentu PCR quantitatiu per rinvià l'esperimentu di PCR in Tempu Reale.

Pobre ripetibilità di i valori quantitativi

1.U strumentu hè malfunctioning.
Suggerimentu: Ci ponu esse errori trà ogni foru PCR di l'instrumentu, risultatu in una povira riproducibilità durante a gestione di a temperatura o a rilevazione.Per piacè verificate secondu l'istruzzioni di u strumentu currispundenti.

2.A purità di mostra ùn hè micca bè.
Raccomandazione: I campioni impuri portanu à una povira riproducibilità di l'esperimentu, chì include a purità di u mudellu è i primi.Hè megliu ripurificà u mudellu, è i primi sò megliu purificati da SDS-PAGE.

3.U sistema di preparazione PCR è u tempu di almacenamiento hè troppu longu.
Suggerimentu: Aduprate u sistema di PCR in Tempu Reale per l'esperimentu di PCR immediatamente dopu a preparazione, è ùn lasciate micca per troppu longu.

4.I cundizioni di amplificazione di PCR ùn sò micca adattati, è a sequenza di prima o cuncentrazione hè impropriu.
Suggerimentu: cunfirmà a correzzione di a sequenza di prima è u primu ùn hè micca degradatu;se u signale di amplificazione ùn hè micca bonu, pruvate à calà a temperatura di annealing è aghjustate a cuncentrazione di prima in modu adattatu.

5.U sistema PCR hè impropriu, o u sistema hè troppu chjucu.
Suggerimentu: U sistema di reazzione PCR hè troppu chjucu farà diminuite a precisione di rilevazione.Hè megliu aduprà u sistema di reazzione cunsigliatu da l'instrumentu PCR quantitatiu per rinvià l'esperimentu di PCR in Tempu Reale.