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Descrizzioni

Stu kit usa un sistema di buffer di lisi unicu chì pò liberà rapidamente RNA da campioni di cellule cultivate per reazioni RT-qPCR, eliminendu cusì u prucessu di purificazione di RNA laborioso è laborioso.U mudellu RNA pò esse acquistatu in solu 7 minuti.I reagenti 5×Direct RT Mix è 2×Direct qPCR Mix-SYBR forniti da u kit ponu ottene risultati PCR quantitativi in ​​tempu reale in modu rapidu è efficace.

5×Direct RT Mix è 2×Direct qPCR Mix-SYBR anu una forte tolleranza di l'inibitore, è u lisatu di i campioni pò esse usatu cum'è mudellu per RT-qPCR direttamente.Stu kit cuntene l'unica trascrittasi inversa Foregene di alta affinità RNA, è Hot D-Taq DNA polimerasi, dNTPs, MgCl₂, buffer di reazione, ottimizzatore di PCR è stabilizzatore.

Specificazioni

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Cumpunenti di u kit

Caratteristiche è vantaghji

■ Semplice è efficace : cù a tecnulugia Cell Direct RT, i campioni di RNA ponu esse ottenuti in solu 7 minuti.

■ A dumanda di mostra hè chjuca, quant'è 10 cellule ponu esse pruvati.

■ High throughput: pò detect rapidamente RNA in cellule cultivate in 384, 96, 24, 12, 6-well plates.

■ DNA Eraser pò sguassà rapidamente i genomi liberati, riducendu assai l'impattu nantu à i risultati sperimentali successivi.

■ U sistema RT è qPCR ottimisatu rende a trascrizione inversa RT-PCR in dui passi più efficace è a PCR più specifica, è più resistente à l'inibitori di a reazione RT-qPCR.

Applicazione di kit

Campo d'applicazione: cellule in coltura.

- RNA liberatu da a lisi di campioni: applicabile solu à u mudellu RT-qPCR di stu kit.

- U kit pò esse usatu per i seguenti scopi: analisi di l'espressione genica, verificazione di l'effettu di silenziu di u genu mediatu da siRNA, screening di droga, etc.

Diagramu

Stoccaggio e vita di conservazione

A parte I di stu kit deve esse guardatu à 4 ℃;Part II deve esse guardatu à -20 ℃.

Foregene Protease Plus II deve esse almacenatu à 4 ℃, ùn congelate micca à -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR deve esse guardatu à -20 ℃ in u bughju;s'è usatu friquintimenti, si pò dinù esse cullucatu à 4 ℃ per u almacenamentu cortu-termine (usu in 10 ghjorni).Vincitu a maiuranza in e certificazioni cruciali di u so mercatu per Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, A qualità hè a vita di a fabbrica, Focus in a dumanda di u cliente hè a fonte di sopravvivenza è sviluppu di a cumpagnia, Aderemu à l'onestà è l'attitudine di travagliu di bona fede, aspittendu a vostra venuta!
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QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Per a RT-qPCR diretta cellulare utilizendu ≤ 1000 000 cellule

Introduzione di u produttu

Stu pruduttu usa un sistema di buffer di lisi unicu per liberà rapidamente l'RNA da campioni di cellule cultivate per reazioni RT-qPCR, eliminendu u prucessu di purificazione di RNA laborioso è laborioso, è solu 7 minuti per ottene u mudellu di RNA necessariu, cù u 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman furnitu da u kit pò ottene risultati PCR in tempu reale è quantitativamente.

5 × Direct RT Mix è 2 × Direct qPCR Mix-Taqman anu una forte tolleranza di l'inibitore è ponu realizà una inversione efficace è amplificazione specifica utilizendu u lisatu di a mostra per esse misurata cum'è mudellu.U reagente cuntene Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, chì pò esse usatu cù buffer di lisi per detectà rapidamente è facilmente campioni, è hà e caratteristiche di alta sensibilità, specificità è stabilità.

Caratteristiche di u produttu

Tecnulugia simplice è efficace Cell Direct RT chì dura appena 7 minuti per ottene campioni di RNA.

I requisiti di mostra sò chjuchi, è un minimu di 10 cellule cultivate pò esse usatu per l'esperimentazione.

High throughput per l'acquisizione rapida di RNA di e cellule cultivate cum'è 384, 96, 24, 12 è 6-well plates.

DNA Eraser hè capaci di sguassà rapidamente i genomi liberati, riducendu assai l'impattu nantu à i risultati sperimentali successivi.

I sistemi RT è qPCR ottimizzati permettenu RT-PCR in dui tappe cù una trascrizione inversa più efficiente, specificità è una tolleranza più forte di l'inibitore di a reazione RT-qPCR.

Applicazione di kit

Campo d'applicazione: Cellule in coltura.

RNA interpretatu da a lisi di mostra: utilizatu solu cum'è mudellu RT-qPCR in dui passi.

I kits ponu esse aduprati per i seguenti scopi: analisi di l'espressione di regulazione genica, teste di alleli, screening di droga, etc.

Limitazioni di u kit

Frammenti amplificati ≤ 300 bp.

I kits sò usati per cultivà e cellule fresche.

Controlu di qualità di u produttu

Sicondu u Sistema di Gestione di Qualità Totale di FOREGENE, ogni lotto di kit di serie Cell Direct RT-qPCR hè rigurosamente testatu parechje volte per assicurà l'affidabilità è a stabilità di a qualità di ogni batch di kit.

U cuntenutu di u kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2×Direct qPCR Mix-Taqman pò esse acquistatu separatamente, i dettagli sò furniti in l'Appendice 1 (PAGINA 13).

Cundizioni di almacenamiento

1. Cundizioni di spedizione

Tuttu u prucessu di trasportu di scatula di ghiaccio à bassa temperatura, per assicurà chì u kit hè in u statu <4 °C.

2. Cundizioni di almacenamiento

Conservez la partie I à 4 °C et la partie II à -20 °C.

U Foregene Protease Plus II deve esse conservatu à 4 ° C, micca congelatu à -20 ° C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman hè almacenatu à -20 ° C, o à 4 ° C per l'usu di cortu termini s'ellu hè adupratu spessu (in 10 ghjorni).

infurmazione di cumpunenti di u kit

Buffer CL: Fornisce l'ambiente necessariu per e reazioni di lisi cellulare.

Buffer ST: Termina a sustanza attiva in u lisatu per evità l'effetti nantu à RT sussegwenti.

DNA Eraser: DNA remover, l'effettu di caccià u genoma in esperimenti successivi.

5 × Direct RT Mix: Contiene alta affinità di RNA Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and reverse trascription primers per un allineamentu ottimale (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: In u cuntestu di u buffer di lisi, e cellule sò lisate per liberà l'acidi nucleici.

2 × qPCR diretta Mix-Taqman: Stu reagente cuntene Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, buffer di reazione, ottimizzatore di PCR è stabilizzatore.

20 × ROX Reference Dye: Generally used on Real Time PCR amplification instruments of ABI, Stratagene and other companys, hè adupratu per aghjustà a diffarenza trà i tubi PCR è i tubi causati da errori di dosing PCR.A concentrazione di 20 × ROX Reference Dye necessaria per diversi strumenti hè diversa, è l'utilizatore pò aghjunghje secondu a cuncentrazione cunsigliata di u strumentu.

DdH senza RNase₂O: Acqua ultra pura sterilizzata senza RNasi per reazioni RT-qPCR in due fasi.

Precauzioni:(Assicurati di leghje attentamente e precauzioni prima di utilizà u kit)

Prestate attenzione à u metudu di u funziunamentu di l'esperimentu per evità a contaminazione incruciata trà e mostre.

Prestate attenzione à a pulizia di l'ambiente sperimentale è di l'utensili per evità a contaminazione da RNase è a degradazione di l'RNA.

Pigliate campioni di cellule fresche o ben conservate è ùn aduprate mai campioni di cellule congelate-scongelate ripetute.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman deve evità ripetuti congelamenti-scongeli, altrimenti affetta a trascrizione inversa e l'efficienza di PCR.

Preparazioniprimafunziunamentu

Assicuratevi di leghje attentamente l'istruzzioni prima di utilizà stu kit.U Cell Direct RT-qPCR Kit hè simplice, convenientu è rapidu per uperà, è l'istruzzioni furniscenu infurmazioni cumplete nantu à u kit sanu è cumu si usanu currettamente.Per piacè preparate i materiali sperimentali è l'equipaggiu necessarii prima di l'usu.

Materiali è equipaghji sperimentali

◆ Culture cells.

◆ 1,5 ml o 2 ml, tubo da centrifuga senza RNasi/DNase, punta senza RNase/DNase, tubo qPCR sterile da 0,2 ml.

◆ qPCR macchina, pipetta, centrifuga da tavola (≥13 400×g) (secondu i bisogni sperimentali), etc.

Sicurezza

◆ Stu pruduttu hè solu per scopi di ricerca scientifica, per piacè ùn l'utilizate micca per scopi farmaceutici, clinichi, alimentari è cosmetichi.

◆ Quandu aduprate sustanzi chimichi, portate vestiti di laboratoriu adattati, guanti, occhiali protettivi, etc.

Operazioneguide

I sistemi di lisi cellulare, i sistemi RT è i pacchetti di supplementi di soluzione di reazione qPCR ponu esse acquistati separatamente, per i dettagli in l'Appendice 1 (PAGINA 13).

Guida di u funziunamentu

A: Liberazione di RNA di l'échantillon

1.Celluli sò stati pretrattati: Lavate a piastra di cultura cellulare cù PBS friddu, poi lisate e cellule (10-10).⁶), 10⁶ rispetto alla quantità di cellule, si consiglia Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) o Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) per l'estrazione e la purificazione di RNA.

1.1.Cellule aderenti (piastra à 24 pozzi per esempiu)

1.1.1.Determina u numeru di cellule in ogni pozzu, determina chì u numeru di cellule hè 1 × 10⁵, è utilizate una pipetta per sguassà u mediu di cultura da u platu di cultura.

1.1.2.Aghjunghjite 200 μl di 1 × PBS pre-chilled à ogni pozzu.Ùn pipettate ripetutamente è sguassate PBS da i pozzi.Inclinate a piastra è sguassate u più PBS pussibule.Avanzate à u passu 2.

1.1.3.Diversi piatti di cultura cellulare o una tabella di numeri di riferimentu 1-1 in un platu di cultura cellulare hè stata aghjunta precooled 1 × PBS per lavà e cellule.

Tabella 1-1: dosage PBS per parechji numeri di cellule

Nota:Per assicurà una ferma aderenza di e cellule,un gran numaru di perdita di cellule evitata durante u lavatu.

1.2.Cellule in sospensione o cellule aderenti coltivate in piastre non porose

1.2.1.Cellule aderenti cultivate in platti non-multi well (cellule di sospensione cumincianu da u prossimu passu 1.2.2), cullighjate è separà i celluli secondu u metudu di cullizzioni di cellula normale, è mette in una piastra di cultura o un tubu di centrifuga;Se a tripsinizazione hè aduprata, esige centrifugazione per cullà e cellule è per sguassà a tripsina residuale, aghjunghjite cellule risuspendite PBS in cellule individuali per disperse e cellule.

1.2.2.Dopu à u numeru di cellula cuntatu, aliquoted cells 1 × 10⁵ unu per centrifugare i tubi, raccoglie cellule per centrifugazione a 1000 × g per 10 min.

1.2.3.Aghjunghjite 200 μl di PBS à u tubu di centrifuga, ùn pipettate ripetutamente, è direttamente aspirate u PBS.procede à u passu 2. (Se hè difficiule di precipitate è e cellule sò state resuspended di novu, pò esse realizatu 1000 × g centrifugati 10 min dopu à scartà u supernatant, u pellet cellula passa à u passu 2)

2.Cell lysis: Remove Buffer CL, a so temperatura equilibrated à a temperatura di l'ambienti, DNA Eraser è Foregene Protease Plus II, secondu a seguente tabella 1-2 sistema di lisi preparatu: (soluzione Lysis hè pronta per l'usu).

Table1-2: clivage preparazione di u sistema (Nota: in a preparazione nantu à u ghjacciu)

3. (Piastra à 24 pozzetti cum'è un esempiu) Pipette 200 μl di mischju maestru di lisi cellulare in ogni pozzu, soffiate ripetutamente 5-10 volte, Incubate à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per 5 min.

Nota:Per evità a furmazione di bolle, per piacè, quandu a pipetta scala di pipette hè stata aghjustata à 200μl o menu.I celluli ponu appare nuvole dopu a lisi, chì hè normale.

4.(24 -well plate cum'è un esempiu) hè aghjuntu in u liquidu 20 μl Buffer ST (differenti sistemi di lisi Buffer ST aghjuntu in una quantità indicata in Table 1-3), ripetutu pipetting 5-10 volte, à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) sò stati incubati per 2 min.

Nota:A punta di pipette disposta sottu à a superficia, assicurendu chì u lysate hè aghjuntu,per evità a furmazione di bolle, per piacè, quandu a pipetta scala di pipette hè stata aghjustata à 200μl o menu.

Table 1-3:Aghjunghjite Buffer ST

5.U lysate hè utilizatu per l'esperimenti RT-qPCR sussegwenti.Se l'esperimenti successivi ùn ponu esse realizati in u tempu, tenete nantu à u ghjacciu per micca più di 2 ore, è guardate à -20 ℃ o -80 ℃ (micca più di trè mesi).

B: preparazione di u sistema RT

1.Take out 5 × Direct RT Mix è mette nantu à un bagnu di ghjacciu, lasciate funnu naturali, è mischjà delicatamente per un usu più tardi;caccià RNase-Free ddH2O è funnu è mette nantu à un bagnu di ghiaccio per u usu dopu.Preparate u sistema di reazzione nantu à u ghjacciu secondu a Table 2-1 sottu.

Table 2-1: Preparazione di u sistema di reazzione RT

2.After cumpiimentu di furmulazzioni sistemu, mischjà dolcemente è centrifuged brevi in ​​u tavulu seguenti 2 -2 cundizioni reazzione RT reazione.

Tabella 2-2: Impostazione di e cundizioni di reazione RT

3.Dopu à a fine di a reazione, u pruduttu di a reazione hè stata posta direttamente nantu à u ghjacciu per qPCR, per piacè mette a preservazione à longu andà -20 ℃ o -80 ℃.

Nota: A causa di l'usu di mudellu micca purificatu, i precipitati bianchi ponu appare in u pruduttu di trascrizione inversa.Questu hè un fenomenu normale.Centrifuga u supernatant immediatamente per esperimenti successivi.

A suluzione di reazzione RT risultante hè aghjuntu à i sistemi di reazzione PCR in Tempu Reale Step, hè cunsigliatu per aghjunghje quantità chì varienu da 10-30% di u sistema di reazione.

C: preparazione di sistema di reazione qPCR

1.Appropriate quantità di B preparatu in u passu mudellu cDNA secondu a seguente tabella 3-1 per preparà un sistema di reazzione.

Nota: A quantità di mudellu di cDNA conta per 10-30% di u sistema qPCR.Per esempiu, in un sistema qPCR 20μl, aghjunghje 2-6 μl di buffer di lisi, ma micca più di 6 μl.

2.The ottimisazione boni cundizioni qPCR (Temperatura annealing，etc.) per a reazzione qPCR (I cundizioni di reazzione datu à Table 3-2).

Nota: Pruvate d'utilizà e cundizioni ottimisate per e reazioni qPCR per ottene risultati megliu.

Table 3-1: Preparazione di u sistema di reazzione PCR

1*: A cuncentrazione di primer pò esse aghjustata in u intervalu di 50-900 nM quandu u rendiment di reazione di primer hè poviru.

Nota: U sistema qPCR pò esse aghjustatu secondu i bisogni sperimentali è u mudellu di ciclor di fluorescenza.Per qPCR in un 50μl sistema, aghjustate a dosa di reagenti proporzionalmente secondu u 20μl sistema.

2*: Selezziunate a cuncentrazione finale adatta di ROX Reference Dye secondu u termociclatore quantitativo di fluorescenza.I cuncentrazioni ROX Reference Dye più adatte per i ciclatori quantitativi di fluorescenza cumuni sò mostrati in a tabella sottu:

Table 3-2: e cundizioni di reazione qPCR sò furnite

Nota: Per ottene u megliu effettu qPCR, a PCR di gradiente pò esse usata per ottimisà e cundizioni di reazione per diversi mudelli è diversi primers.E cundizioni di reazione PCR varienu secondu l'analizzatore di fluoriscenza, u mudellu, u primer, etc. In l'operazione specifica, e cundizioni ottimali di reazione deve esse disignate secondu e cundizioni specifiche di u ciclor termicu quantitativo di fluorescenza, u tipu di mudellu, a dimensione di u fragmentu d'interessu, a sequenza di basa di u frammentu amplificatu è u cuntenutu GC è a durata di i primers, cumprese a temperatura di annealing, u tempu di reazione, etc.

Principii di design di primer PCR in tempu reale

Prima prima è prima inversa

Per a PCR in Tempu Reale, u disignu di primer hè assai impurtante.I primers sò ligati à a specificità è l'efficienza di l'amplificazione PCR, è ponu esse designati cun riferimentu à i seguenti principii:

◆ Lunghezza di prima: 18-30bp.

◆ cuntenutu GC: 40-60%.

◆ Valore Tm: U software di cuncepimentu di Primer, cum'è Primer 5, pò dà u valore Tm di u primu.Les valeurs de Tm des amorces en amont et en aval doivent être les plus proches possibles.A formula di calculu Tm pò ancu esse usata: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Quandu si esegue a PCR, una temperatura sottu à u valore Tm di l'amorce di 5 ° C hè generalmente sceltu cum'è a temperatura di annealing (l'aumentu currispundente di a temperatura di annealing pò aumentà a specificità di a reazione PCR).

◆ Primers è prudutti PCR:

◆ Disegnu primer PCR amplification lunghezza prodottu hè preferibile 100-150bp.

◆ Prima di disegnu in l'area strutturale secundaria di u mudellu deve esse evitata quant'è pussibule.

◆ Evitate a furmazione di 2 o più basi cumplementarii trà l'estremità 3' di i primers upstream è downstream.

◆ Base terminal Primer 3′ ùn pò esse presente cù 3 G o C consecutivi supplementari.

◆ I primi stessi ùn ponu micca strutture cumplementarii, altrimenti una struttura di hairpin serà furmata, affettendu l'amplificazione di PCR.

◆ ATCG deve esse distribuitu u più uniformemente pussibule in a sequenza di prima, è a basa terminale 3′ deve esse evitata cum'è T.

Appendice1:Cu direttuRT-qPCR Cumpunente di u kitt pacchettu supplementu

1.Cell Lysis Solution