Sterilizzazione di puntali di pipette e tubi EP, ecc.
1. Preparate 0,1% (una millesima) DEPC (sustanza altamente tossica) cù l'acqua deionizzata, l'utilizate cù cura in una cappa di fume, è l'almacenà à 4 ° C luntanu da a luce;
L'acqua DEPC hè acqua pura trattata cù DEPC è sterilizzata da alta temperatura è alta pressione.Pruvatu per esse liberu di RNase, DNase è proteinasi.
2. Mette a punta di pipette è u tubu EP in 0,1% DEPC, è assicuratevi chì a punta di pipette è u tubu EP sò pienu di 0,1% DEP.
3. Prutegge da a luce, lasciate stà, per a notte (12-24h)
4. A scatula chì cuntene a punta è u tubu EP ùn hà micca bisognu à immerse in DEPC.Dopu avè toltu apprussimatamente l'acqua DEPC in a punta o u tubu EP, imballà è imballa.
5. 121 gradi Celsius, 30min
6. 180 gradi Celsius, seccu per parechje ore (almenu 3 ore)
Nota: a.Purtate guanti di lattice è maschere quandu manipule DEPC!b, o senza sterilizazione DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (assai laboratori sterilizazione alta temperatura duie volte)
Considerazioni per l'estrazione di RNA
Dui fenomeni maiò di fallimentu di l'isulazione di l'RNA di tissutu
degradazione di l'RNA è residui di impurità in i tessuti,in quantu à a degradazione, vedemu prima perchè l'RNA estratto da e cellule cultivate ùn hè micca facilmente degradatu.I reagenti di estrazione di RNA esistenti cuntenenu tutti cumpunenti chì inibiscenu rapidamente RNase.Aghjunghjite u lysate à e cellule cultivate, è simpricimenti mischjà, tutte e cellule pò esse mischiate bè cù u lysate, è e cellule sò completamente lisate.Dopu chì e cellule sò lisate, l'ingredienti attivi in u lisatu inibiscenu immediatamente a RNase intracellulare, cusì l'RNA resta intactu.Vale à dì, perchè e cellule cultivate sò facilmente è sanu cuntattate cù u lisatu, u so RNA ùn hè micca facilmente degradatu;per d 'altra banda, l'RNA in u tissutu hè facilmente degradatu perchè e cellule in u tissutu ùn sò micca faciuli di cuntattà rapidamente u lisatu.a causa di un cuntattu abbastanza.Allora,assumendu chì ci hè una manera di trasfurmà u tissutu in una sola cellula mentre inibisce l'attività di RNA, u prublema di degradazione puderia esse risolta cumplettamente.
A fresatura di nitrogenu liquidu hè u metudu più efficace.Tuttavia, u metudu di fresatura di nitrogenu liquidu hè assai fastidiosu, soprattuttu quandu u numeru di campioni hè grande.Questu hà datu u prossimu megliu: l'homogeneizatore.UomogeneizatoreU metudu ùn cunsiderà micca a quistione di cumu l'attività di RNase hè inibita prima chì e cellule sò cuntattate cù u lisatu, ma piuttostu prega chì u ritmu di disrupzione di u tissutu hè più veloce di u ritmu à quale RNase intracellulare degrada RN.
L'effettu di l'omogenizatore elettricu hè megliu,è l'effettu di homogenizer vetru hè poviru, ma in generale, u metudu homogenizer ùn pò impedisce u fenomenu degradation.Per quessa, se l'estrazione hè degradata, l'homogeneizatore elettricu originale deve esse usatu per a macinazione cù nitrogenu liquidu;l'omogenizatore di vetru uriginale deve esse cambiatu à un homogenizer electricu o direttamente fresatu cù nitrogenu liquidu.U prublema hè quasi 100% fattibile.risolve.
U prublema di residuu di impurità chì affettanu esperimenti successivi hà cause più diverse di a degradazione, è e soluzioni sò currispundenu diverse.In cunclusioni,s'ellu ci hè degradazione o impurità residuali in u tissutu, u metudu di estrazione / reagentu per u materiale sperimentale specificu deve esse ottimizatu.Ùn avete micca aduprà i vostri preziosi campioni per l'ottimisazione: pudete cumprà parechji animali chjuchi cum'è pesci / pollastre da u mercatu, pigliate a parte currispondente di u materiale per l'estrazione di RNA, è l'altra parte per l'estrazione di a proteina - grind with mouth, stomach and intestines Extract.
L'RNA di destinazione di l'RNA estratto hè utilizatu per diversi esperimenti di seguitu, è i so esigenze di qualità sò diffirenti
A custruzzione di a biblioteca di cDNA richiede l'integrità di l'RNA senza residui di l'inibitori di a reazione enzimatica;U Nordu necessita una integrità di RNA più altu è requisiti più bassi per i residui d'inibitori di reazzione enzimatica;RT-PCR ùn richiede micca una integrità di RNA troppu alta,ma inibisce e reazzione enzimatica.I requisiti di residuu sò stretti.L'input determina l'output;ogni volta chì u scopu hè di ottene u RNA di purità più altu, costarà a ghjente è i soldi.
Raccolta / Conservazione di Campioni
Fattori chì Affettanu a Degradazione Dopu chì a mostra abbanduneghja u corpu vivu / o l'ambiente di crescita originale, l'enzimi endogene in a mostra cumincianu à degradà l'RNA,è a rata di degradazione hè ligata à u cuntenutu di l'enzimi endogeni è a temperatura.Tradizionalmente, ci sò solu duie manere di inibisce cumplettamente l'attività di l'enzima endogena: aghjunghje lisatu immediatamente è homogenizeghja bè è rapidamente;cut in picculi pezzi è congelate immediatamente in nitrogenu liquidu.I dui approcci necessitanu operazione rapida.L'ultime hè adattatu per tutti i campioni, mentre chì u primu hè adattatu solu per tissuti cun pocu cuntenutu di celluli è enzimi endogeni è più faciuli d'homogeneizà.In particulare, u tessulu vegetale, u fegatu, u timu, u pancreas, u spleen, u cervellu, u grassu, u tissutu musculare, etc. sò megliu congelati cù nitrogenu liquidu prima di prucede.
Fragmentazione è homogenizazione di i campioni
Fattori chì Affettanu a Degradazione è u Rendimentu A frammentazione di u Campione hèper un'omogeneizazione completa, chì hè per a liberazione cumpleta è cumpleta di RNA.I celluli ponu esse homogeneizzati direttamente senza esse rottu.I tissuti ponu esse homogeneizzati solu dopu esse rottu.U levitu è i battìri anu da esse rottu cù l'enzimi currispondenti prima di pudè esse homogenizate.Tessuti cù u cuntenutu di l'enzima endogenu più bassu è l'omogenizazione più faciule pò esse sfracicatu è homogenized à un tempu in u lisatu da un homogenizer;Tessuti vegetali, fegato, timu, pancreas, milza, cervellu, grassu, tissutu musculare è altri campioni, sò o ricchi di enzimi endogeni o ùn sò micca facilmente omogeneizzati,cusì a disrupzione di tissuti è l'homogenizazione deve esse realizatu separatamente.U metudu più affidabile è più pruduttivu di frammentazione hè a fresatura cù nitrogenu liquidu, è u metudu più affidabile di l'homogeneizazione hè l'usu di un homogenizer electricu.Una nota speciale nantu à a fresatura cù nitrogenu liquidu: a mostra ùn deve esse scongelata durante tuttu u prucessu di fresatura, postu chì l'enzimi endogeni sò più prubabile di funziunà quandu sò congelati.
Scelta di lisatu
Affettendu a cunvenzione di u funziunamentu è i fatturi di impurità endogeni residuali I suluzioni di lisi cumunimenti usati ponu quasi inibisce l'attività di RNase.Per quessa, u puntu chjave di sceglie una suluzione di lisi hè di cunsiderà in cumbinazioni cù u metudu di purificazione.Ci hè una eccezzioni:I campioni cù un altu cuntenutu di enzimi endogeni sò cunsigliati per utilizà un lisatu chì cuntene fenol per aumentà a capacità di inattivà l'enzimi endogeni.
Scelta di u metudu di purificazione
Fattori chì affettanu impurità endogeni residuali, velocità di estrazione Per i campioni puliti, cum'è e cellule, i risultati satisfacenti ponu esse ottenuti cù quasi ogni metudu di purificazione in manu.Ma per parechje altre mostre, in particulare quelli chì anu un altu livellu di impurità, cum'è e piante, u fegatu, i batteri, etc., sceglie un metudu di purificazione adattatu hè cruciale.U metudu di purificazione centrifuga di colonna hà una velocità d'estrazione rapida è pò eliminà in modu efficace l'impurità chì affettanu a reazione enzimatica successiva di l'RNA, ma hè caru (Foregene pò offre kits convenienti, più dettagli cliccatequì);usendu metudi di purificazione ecunomica è classica, cum'è a precipitazione LiCl, pò ancu ottene risultati satisfacenti, ma u tempu di operazione hè longu..
"Trè Discipline è Ottu Attenzione" per l'estrazione di RNA
Disciplina 1:Pone fine à a contaminazione di l'enzimi esogeni.
Nota 1:Purtate strettamente maschere è guanti.
Nota 2:I tubi di centrifuga, teste di punta, bastone di pipette, cisterna elettroforesi, è banche spirimintali implicati in l'esperimentu deve esse sguassati bè.
Nota 3:I reagenti / suluzione implicati in l'esperimentu, in particulare l'acqua, deve esse senza RNase.
Disciplina 2:Bloccà l'attività di l'enzimi endogeni
Nota 4:Sceglite un metudu di homogenizazione adattatu.
Nota 5:Sceglite un lisatu adattatu.
Nota 6:Cuntrolla a quantità iniziale di a mostra.
Disciplina 3:Chjarificà u vostru scopu di estrazione
Nota 7:Cù ogni sistema di lisatu chì si avvicina à a quantità massima iniziale di mostra, a rata di successu di l'estrazione cade drasticamente.
Nota 8:L'unicu criteriu ecunomicu per l'estrazione di RNA successu hè un successu in esperimenti successivi, micca rendiment.
Top 10 Fonti di Contaminazione RNase
1. I dita sò a prima fonte di enzimi esogeni, cusì i guanti devenu esse purtati è rimpiazzati spessu.Inoltre, e maschere deve esse purtate ancu, perchè a respirazione hè ancu una fonte impurtante di enzimi.Un benefiziu supplementu di portà una maschera di guanti hè di prutezzione di l'esperimentatore.
2. Pipette tips, centrifuge tubes, pipettes - RNase ùn pò micca esse inattivatu da sterilizazione sola, cusì i punte di pipette è i tubi di centrifuga deve esse trattatu cù DEPC, ancu s'elli sò marcati cum'è DEPC trattati.Hè megliu aduprà una pipetta speciale, sguassate cù una bola di cuttuni 75% alcolu prima di l'usu, in particulari u bastone;in più, assicuratevi di ùn aduprà un remover di testa.
3. L'acqua / buffer deve esse senza contaminazione RNase.
4. Almenu a tavula di prova deve esse sguassata cù boli di cuttuni 75% alcolu.
5.Endogenous RNase Tutti i tessuti cuntenenu enzimi endogeni, cusì a congelazione rapida di tissuti cù nitrogenu liquidu hè u megliu modu per riduce a degradazione.U metudu di almacenamiento / macinazione di nitrogenu liquidu hè veramente inconveniente, ma hè l'unicu modu per i tessuti cù alti livelli di enzimi endogeni.
6. Esempi di RNA I prudutti d'estrazione di RNA ponu cuntene tracce di contaminazione da RNase.
7. L'estrazione di Plasmid L'estrazione di Plasmid spessu usa Rnase per degrada l'RNA, è a Rnase residuale deve esse digerita cù Proteinase K è estratta da PCI.
8. L'almacenamiento di RNA Ancu s'ellu hè almacenatu à bassa temperatura, tracce quantità di RNase pruvucarà a degradazione di l'RNA.A megliu suluzione per a preservazione à longu andà di l'RNA hè una sospensione di sal / alcolu, perchè l'alcohol inibisce tutte l'attività enzimatica à bassa temperatura.
9. Quandu i cationi (Ca, Mg) cuntenenu sti ioni, u riscaldamentu à 80C per 5 minuti pruvucarà RNA à esse cleaved, perchè s'ellu ci hè bisognu di calà l'RNA, a suluzione di preservazione deve cuntene un agenti chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).
10. L'enzimi utilizati in esperimenti successivi ponu esse contaminati da RNase.
10 Cunsiglii per l'estrazione di RNA
1: Prevene rapidamente l'attività di RNase.I campioni sò rapidamente congelati dopu a cullizzioni, è a RNase hè inattivata da una operazione rapida durante a lisi.
2: Sceglite un metudu d'estrazione adattatu per u tissutu cù un altu cuntenutu di ribozima, è u tessulu adiposu hè megliu aduprà u metudu chì cuntene fenol.
3: A qualità di prediczione richiede u Nordu, a custruzzione di a biblioteca di cDNA richiede una alta integrità, è RT-PCR è RPA (assay di prutezzione di Ribonuclease) ùn anu micca bisognu di alta integrità.RT-PCR richiede alta purezza (residui di inibitori enzimatici).
4: L'omogeneizazione completa hè a chjave per migliurà u rendiment è riduce a degradazione.
5: Verificate l'integrità di a rilevazione di l'elettroforesi di RNA, 28S: 18S = 2: 1 hè un signu cumpletu, 1: 1 hè ancu accettatu per a maiò parte di l'esperimenti.
6: Rimozione di DNA per RT-PCR, analisi di array Hè megliu aduprà Dnase I per sguassà DNA.
7: Reduce a contaminazione di l'enzimi esogeni - l'enzimi ùn ponu esse impurtati da l'esternu.
8: Quandu si cuncentra l'acidu nucleicu di cuncentrazione bassa, un reagentu di co-precipitazione deve esse aghjuntu.Ma per prevene u co-precipitant chì cuntene enzimi è a contaminazione di DNA.
9: dissolve bè l'RNA, se ne necessariu, calore à 65C per 5 minuti.
metudu di almacenamentu adattatu
Pò esse guardatu à -20C per un pocu tempu, è à -80C per un bellu pezzu.U primu passu per migliurà i rendimenti di RNA hè di capisce chì u cuntenutu di RNA di diversi campioni varieghja assai.Abbundanza alta (2-4ug/mg) cum'è fegato, pancreas, cori, abbundanza media (0,05-2ug/mg) cum'è cervellu, embrione, rino, pulmone, timu, ovariu, abbundanza bassa (<0,05ug/mg) mg) cum'è vejiga, ossa, grassu.
1: Lise e cellule per liberà RN - se l'RNA ùn hè micca liberatu, u rendiment serà ridutta.L'omogenizazione elettrica funziona megliu cà l'altri metudi d'homogeneizazione, ma pò ancu avè bisognu à esse cumminata cù altri metudi, cum'è a machja di nitrogenu liquidu, a digestione enzimatica (Lysozyme / Lyticase)
2: Optimization di u metudu d'estrazzioni.I prublemi maiò cù i metudi basati in fenoli sò stratificazione incompleta è perdita parziale di RNA (u supernatant ùn pò micca esse eliminatu).A stratificazione incompleta hè duvuta à l'altu cuntenutu di l'acidu nucleicu è di a proteina, chì pò esse risolta aumentendu a quantità di lisatu utilizatu o riducendu a quantità di mostra.Un passu di l'estrazione di cloroformu hè aghjuntu à u tessulu adiposu.A perdita di RNA pò esse ridutta da back-pumping o sguassate a strata organica seguita da centrifugazione.U prublema più grande cù i metudi basati in centrifugazione di colonna hè l'eccessu di mostra.
Cunsiglii di estrazione classica
1. Purificazione di fenol: aghjunghje un voluminu uguali di 1: 1 Phenol / Chloroform è mischjà vigorosamente per 1-2 minuti.Centrifuga à alta velocità per 2 minuti.Eliminate cù cura u supernatant (80-90%).Ùn mai ghjunghje à a capa media.Un voluminu uguali di a suluzione di reazione pò esse aghjuntu à Phenol / Chloroform è u supernatant eliminatu.I dui supernatanti ponu esse mischiati inseme per a precipitazione di l'acidu nucleicu per migliurà u rendiment.Ùn esse micca troppu gentile quandu mischjà, è ùn pruvate micca di sguassà tuttu u supernatant.
2. Lavà cù 70-80% etanol: Durante u lavu, l'acidu nucleicu deve esse suspesu per assicurà chì u salitu residuale hè lavatu.À u listessu tempu, subitu dopu à versà l'etanol, centrifuga à alta veloce per uni pochi sicondi, è poi sguassate l'etanol residuale cù una pipetta.Dissolve dopu à a temperatura di l'ambienti per 5-10 minuti.
11. Estrazione di urganisazione speciale
1. Tessulu fibrosu: A chjave per l'estrazione di RNA da u tessulu fibru, cum'è u musculu core / skeletal hè di disturbà completamente u tissutu.Questi tissuti anu una densità di cellula bassa, cusì a quantità di RNA per unità di pesu di tissutu hè bassu, è hè megliu aduprà quant'è quantità iniziale pussibule.Assicuratevi di macinà u tissutu bè in cundizioni di congelazione.
2. Tessuti cun altu cuntenutu di proteina / grassu: u cuntenutu di grassu di u cervellu / vegetale hè altu.Dopu l'estrazione di PCI, u supernatant cuntene flocculi bianchi.U supernatant deve esse riestratu cù cloroformu.
3. Tessuti cun altu cuntenutu di l'acidu nucleicu / ribozyme: u spleen / thymus hà un altu cuntenutu di l'acidu nucleicu è ribozyme.U tissutu di macinazione in cundizioni di congelazione seguita da una rapida homogenizazione pò inattivà efficacemente i ribozimi.In ogni casu, se u lisatu hè troppu viscosu (per via di un altu cuntenutu di l'acidu nucleicu), l'estrazione di PCI ùn puderà micca stratificà in modu efficace;aghjunghje più lisatu pò risolve stu prublema.Multiple extractions PCI ponu sguassà più DNA residuale.Se un precipitatu biancu si forma immediatamente dopu l'aghjunghje l'alcohol, indica a contaminazione di l'ADN.A riestrazione cù PCI acidicu dopu a dissoluzione pò sguassà a contaminazione di DNA.
4. Tessuti vegetali: U tissutu vegetale hè più cumplessu cà u tissutu animali.In generale, i pianti sò macinati in cundizioni di nitrogenu liquidu, cusì a degradazione di l'RNA da l'enzimi endogeni hè pocu cumuni.Se u prublema di degradazione ùn hè micca risolta, hè quasi certamente causata da impurità cuntenute in a mostra.L'impurità cuntenute in parechje piante portanu à i residui, è u mutivu di i residui hè spessu perchè sti impurità anu parechje similitudini cù RNA: precipitate è precipitate, è adsorbe è adsorbiu.Queste caratteristiche determinanu chì sò inhibitori enzyme assai forti.
Attualmente, i reagenti di estrazione di RNA cummerciale ponu esse adattati à quasi tutti i tessuti animali cù picculi aghjustamenti, ma ci sò pochi reagenti di estrazione di RNA cummerciale chì ponu esse adattati per a maiò parte di i tessuti vegetali.Fortunatamente, Foregene pò furnisce specialikit di estrazione di RNA vegetale, avemuKit d'isolazione di RNA totale di a pianta, Kit d'isolazione di RNA totale di pianta Plus.L'ultime hè apposta per e piante cù un altu cuntenutu di polisaccaridi è polifenoli.Per l'estrazione di RNA, i feedback da l'utilizatori di u labburatoriu sò particularmente boni.
12. L'effettu di a congelazione di a mostra è u scongelu A mostra congelata pò esse più grande, è deve esse tagliata prima di esse utilizata per l'estrazione di RNA.I campioni tendenu à funnu (possibilmente parzialmente) durante u tagliu.I campioni congelati ponu esse pesati prima di l'estrazione di RNA, è u scongelu serà definitu durante stu prucessu.Calchì volta, u scongelu di a mostra si trova ancu durante u prucessu di fresatura di nitrogenu liquidu;o a mostra congelata hè aghjuntu direttamente à u lisatu senza fresatura di nitrogenu liquidu, è u scongelu serà definitu prima di l'homogeneizazione cumpleta.L'esperimenti anu dimustratu chì u tissutu congelatu hè più propensu à a degradazione di l'RNA durante u scongelu cà u tissutu frescu.U mutivu prubabile: U prucessu di congelazione-discongelu disturba e strutture in a cellula, facendu più faciule per l'enzimi endogeni per entra in cuntattu direttu cù l'RNA.
13. Giudiziu di qualità di RNA Di solitu, l'elettroforesi hè aduprata per ghjudicà l'integrità di l'RNA, è A260 / A280 hè utilizatu per ghjudicà a purità di l'RNA.In teoria, l'RNA intactu hà un rapportu di 28S: 18S = 2.7: 1, è a maiò parte di e dati enfatizzanu a ratio di 28S: 18S = 2: 1.U fattu hè chì quasi nimu di l'ARN estratti da i campioni altru da e cellule hè in un rapportu 2: 1 (questu hè statu ottenutu cù l'Agilent Bioanalyzer).
I risultati di l'elettroforesi di RNA sò affettati da parechji fatturi, cumprese a struttura secundaria, e cundizioni di l'elettroforesi, a carica di mostra, u gradu di saturazione di EB, etc. Utilizà l'elettroforesi nativu per detectà l'RNA è l'usu di l'ADN Marker cum'è cuntrollu.Se u 28S à 2kb è u 18S à 0.9kb sò chjaru, è 28S: 18S> 1, l'integrità pò risponde à i bisogni di a maiò parte di l'esperimenti successivi.
A260 / A280 hè un indicatore chì hà causatu assai cunfusioni.Prima di tuttu, hè necessariu di clarificà u significatu uriginale di questu indicatore per l'acidi nucleici: RNA puru, u so A260/280 = circa 2,0.L'RNA puru hè a "causa" è A260/A280 = 2 hè l'"effettu".Avà tutti usanu A260/A280 cum'è "causa", pensendu chì "se A260/A280 = 2, allora l'RNA hè puru", chì naturalmente porta à cunfusione.
Sè site interessatu, pudete aghjunghje un pocu reagentu chì hè spessu usatu in l'estrazzioni, cum'è fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, etc., à a vostra mostra di RNA, è poi misurà a ratio A260 / A280.A realità hè chì parechji di i reagenti utilizati per l'estrazione di RNA, è ancu assai impurità in u campione, assorbanu intornu à A260 è A280, affettendu A260 / A280.
L'approcciu più istruttivu attualmente hè di scansà campioni di RNA in a gamma 200-300 nm.A curva di RNA puru hà e seguenti caratteristiche: a curva hè liscia, A230 è A260 sò dui punti d'inflessione, A300 hè vicinu à 0, A260 / A280 = circa 2.0, è A260 / A230 = circa 2.0.Se i dati di scansione ùn sò micca dispunibili, u rapportu A260 / A230 deve ancu esse determinatu, postu chì questu rapportu hè più sensibile à u trasportu di tutte l'impurità chì affettanu a reazione enzimatica.Pigliate in contu a gamma lineale di u dispusitivu (0,1-0,5 per A260).
Ci sò dui altri fenomeni utili: u rapportu serà di circa 0,3 più bassu quandu A260 / A280 hè misurata in acqua;mentre chì u rapportu misuratu in 10 mM EDTA hè circa 0,2 più altu di quellu misuratu in 1 mM EDTA.
I prudutti cunnessi:
China Plant Total RNA Isolation Kit Produttore è Fornitore |Foregene (foreivd.com)
Serie di isolamentu di RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Tempu di post: Jul-15-2022
