Hè ben cunnisciutu chì in u dogma cintrali, l'RNA hè u mediatore trascrizionale trà DNA è espressione di prutezione.In cunfrontu cù a rilevazione di DNA, a rilevazione di RNA pò riflette più oggettivamente l'espressione genica in l'organisimi.L'esperimenti chì implicanu RNA includenu: qRT-PCR, RNA-Seq, è a rilevazione di geni di fusione, etc. Basatu nantu à e caratteristiche di l'RNA stessu (l'anellu di zuccaru di RNA hà un gruppu idrossilu più liberu cà l'anellu di zuccaru di DNA), accumpagnatu da un gran numaru di RNases in l'ambiente, l'RNA hè più inestabile è più faciule da esse degradatu.Garbage in, garbage out, s'è a qualità di RNA ùn hè micca bonu, allura i risultati spirimintali deve esse unsatisfactory, specificamente manifestatu cum'è dati inaccurate o poviru ripetibilità.Per quessa, più attente deve esse pagatu à u trasfurmazioni di l'RNA, è u ligame di cuntrollu di qualità hè ancu più impurtante per assicurà a precisione è a precisione di e dati sperimentali successivi.

Per u cuntrollu di qualità di RNA, sò generalmente i seguenti metudi cumunimenti usati:

• Spettrofotometria
• elettroforesi su gel di agarosio
• Bioanalizzatore Agilent
• PCR quantitativa fluorescente in tempu reale
• Metudu di tintura fluorescente Qubit

01 Spectrofotometria

L'RNA ha doppi legami coniugati e ha un picco di assorbimento a una lunghezza d'onda di 260 nm.Sicondu a lege di Lambert-Beer, pudemu calculà a cuncentrazione di RNA da u piccu d'absorzione à 260 nm.Inoltre, pudemu ancu calculà a purità di l'RNA secondu u rapportu di picchi di assorbimentu 260nm, 280nm è 230nm.280nm è 230nm sò i picchi di assorbimentu di e proteine ​​​​è e molécule chjuche, rispettivamente.U rapportu di A260 / A280 è A260 / A230 di a purità di RNA qualificata deve esse più grande di 2. S'ellu hè menu di 2, significa chì ci hè una contaminazione di proteina o molecule petite in a mostra di RNA è deve esse purificata di novu.I fonti di cuntaminazione affettanu l'esperimenti downstream, cum'è l'inhibizione di l'efficienza di amplificazione di e reazzioni PCR, risultatu in risultati quantitativi imprecisi.A purità di l'RNA hà una grande influenza nantu à i risultati successivi, cusì a spettrofotometria hè generalmente un ligame indispensabile di cuntrollu di qualità in u primu passu in l'esperimenti di l'acidu nucleicu.

Figura 1. Spettru tipicu di RNA / DNA Assorption Spectrum

02 Elettroforesi in gel d'agarose

In più di a purità, l'integrità di l'RNA hè ancu unu di l'indicatori impurtanti per ghjudicà a qualità di l'RNA.A degradazione di l'RNA portarà à un gran numaru di frammenti brevi in ​​a mostra, cusì u numeru di frammenti di RNA chì ponu esse rilevati in modu efficace è coperto da a sequenza di riferimentu serà ridutta.L'integrità di l'RNA pò esse verificata per l'elettroforesi di l'RNA tutale nantu à un gel di agarose 1%.Stu metudu pò cunfigurà u gel da sè stessu, o aduprà u Sistema E-Gel™ prefabbricatu per a prova di integrità.Più di 80% di l'RNA tutale hè RNA ribosomi, a maiò parte di quale hè cumpostu di 28S è 18S rRNA (in sistemi di mammiferi).L'RNA di bona qualità mostrarà duie barre brillanti evidenti, chì sò 28S è 18S brillanti, rispettivamente, à 5 Kb è 2 Kb, è u rapportu tende à esse vicinu à 2: 1.S'ellu hè in un statu diffuso, significa chì a mostra di RNA pò esse stata degradata, è hè cunsigliatu di utilizà u metudu descrittu dopu per pruvà più a qualità di l'RNA.

Figura 2. Comparazione di RNA degradatu (corsia 2) è intactu (corsia 3) nantu à l'elettroforesi di gel d'agarose

03 Bioanalizzatore Agilent

In più di u metudu di l'elettroforesi di gel d'agarose descrittu sopra, chì pò aiutà à identificà l'integrità di l'RNA in modu simplice è veloce, pudemu ancu aduprà u bioanalizzatore Agilent per determinà l'integrità di l'RNA.Utiliza una cumminazione di microfluidica, elettroforesi capillare è fluorescenza per evaluà a cuncentrazione è l'integrità di l'RNA.Utilizendu l'algoritmu integratu per analizà u prufilu di a mostra di RNA, u bioanalizzatore Agilent pò calculà un valore di integrità di RNA di riferimentu, RNA Integrity Number (in seguitu chjamatu RIN) [1].U più grande u valore di RIN, u più altu l'integrità di l'RNA (1 hè estremamente degradatu, 10 hè u più cumpletu).Certi esperimenti chì implicanu RNA suggerenu di utilizà RIN cum'è un paràmetru per a valutazione di qualità.Pigliendu esperimenti di sequencing high-throughput (in seguitu NGS) cum'è un esempiu, e linee guida di Oncomine ™ Human Immune Repertoire, chì hè aduprata per detectà i receptori di l'antigene di e cellule B è T in a serie di pannelli Oncomine di Thermo Fisher, suggerisce chì i campioni cù valori RIN più grande di 4, letture è cloni più efficaci ponu esse misurati (Figura 3).Ci sò diversi intervalli cunsigliati per diversi pannelli, è spessu un RIN più altu pò purtà dati più efficaci.

Figura 3, in l'esperimenti Oncomine™ Human Immune Repertoire, i campioni cun RIN più grande di 4 ponu detectà letture più efficaci è cloni di cellule T.【2】

Tuttavia, u valore RIN hà ancu qualchì limitazione.Ancu se RIN hà una alta correlazione cù a qualità di e dati sperimentali NGS, ùn hè micca adattatu per i campioni FFPE.I campioni di FFPE sò stati trattati chimicamente per un bellu pezzu, è l'RNA estratto hà generalmente un valore RIN relativamente bassu.Tuttavia, questu ùn significa micca chì i dati efficaci di l'esperimentu deve esse insatisfactory.Per valutà accuratamente a qualità di i campioni FFPE, avemu bisognu di utilizà misure diverse da RIN.In più di RIN, Agilent bioanalyzer pò ancu calculà u valore DV200 cum'è un paràmetru di valutazione di a qualità di RNA.DV200 hè un paràmetru chì calcula a proporzione di frammenti più grande di 200 bp in una mostra di RNA.DV200 hè un indicatore megliu di a qualità di mostra FFPE cà RIN.Per l'RNA estratto da FFPE, hà una correlazione assai alta cù u numeru di geni chì ponu esse rilevati in modu efficace è a diversità di geni [3].Ancu s'ellu DV200 pò cumpensà e carenze in a rilevazione di qualità di FFPE, u bioanalizzatore Agilent ùn pò ancu analizà cumplettamente i prublemi di qualità in campioni di RNA, cumpresu se ci sò inhibitori in i campioni.L'inhibitori stessi ponu influenzà l'efficienza di amplificazione di l'esperimenti downstream è riduce a quantità di dati utili.Per sapè s'ellu ci hè un inhibitore in a mostra, pudemu aduttà u metudu PCR quantitativa fluorescente in tempu reale descrittu dopu.

04 PCR quantitativa fluorescente in tempu reale

U metudu di PCR quantitativa fluorescente in tempu reale ùn pò micca solu detectà l'inhibitori in u campione, ma ancu riflette accuratamente a qualità di l'RNA in a mostra FFPE.Comparatu cù l'analizzatori biologichi Agilent, i strumenti quantitativi di fluorescenza in tempu reale sò più populari in i laboratori biologichi maiò per via di a so applicazione più larga.Per pruvà a qualità di i campioni di RNA, avemu solu bisognu di cumprà o di preparà sonde di primer per i geni di riferimentu internu, cum'è GUSB (Cat no. Hs00939627).Utilizendu stu settore di primers, sonde è standard (RNA tutale di cuncentrazione cunnisciuta) per fà esperimenti quantitativi assoluti, a cuncentrazione di fragmentu RNA efficace pò esse calculata cum'è standard di valutazione di qualità di RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) in breve).In una prova NGS, avemu trovu chì u FRQ di campioni di RNA hà una correlazione assai alta cù u voluminu di dati efficace.Per tutti i campioni più grande di 0.2ng/uL FRQ, almenu u 70% di e letture ponu copre in modu efficace a sequenza di riferimentu (Figura 4).

A figura 4, u valore FRQ rilevatu da u metudu quantitatiu di fluoriscenza hà una correlazione assai alta (R2> 0.9) cù i dati efficaci ottenuti in l'esperimentu NGS.A linea rossa hè u valore FRQ uguale à 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

In più di esse applicabile à i campioni FFPE, u metudu PCR quantitatiu in tempu reale pò ancu monitorà efficacemente l'inibitori in i campioni.Pudemu aghjunghje a mostra per esse rilevata in u sistema di reazione cù u Controlu Positivu Internu (IPC) è u so Assay, è poi eseguisce a quantificazione di fluorescenza per ottene u valore Ct.Se u valore Ct hè in daretu à u valore Ct in a reazione senza campionu, indica chì l'inhibitore hè presente in a mostra è impedisce l'efficienza di amplificazione in a reazione.

05 Metudu di tintura fluorescente Qubit

Qubit Fluorometer hè u picculu strumentu più cumunimenti utilizatu per a cuncentrazione di l'acidu nucleicu è a rilevazione di purità, chì hè faciule d'opere è esiste in quasi tutti i laboratori di biologia moleculare.Calcula accuratamente a cuncentrazione di l'acidu nucleicu detectendu è un colorante fluorescente chì lega l'acidu nucleicu (reagente di rilevazione Qubit).Qubit a une sensibilité et une spécificité élevées, et peut quantifier avec précision l'ARN jusqu'à une concentration pg/µL.In più di a capacità ben cunnisciuta di quantificà accuratamente a cuncentrazione di l'acidu nucleicu, l'ultimu novu mudellu di Thermo Fisher, Qubit 4.0, pò ancu detectà l'integrità di l'RNA.U sistema di rilevazione di RNA di Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) rileva l'integrità di l'RNA detectendu simultaneamente dui coloranti fluorescenti specifichi.Questi dui tinti fluorescenti ponu unisce à i frammenti grossi è i frammenti chjuchi di RNA, rispettivamente.Questi dui tinti fluoriscenti indicanu a proporzione di frammenti grossi di RNA in u sample, è da questu u valore IQ (Integrità è Qualità) chì rapprisenta a qualità di RNA pò esse calculatu.La valeur du QI s'applique à la fois aux échantillons FFPE et non-FFPE, et a une grande influence sur la qualité du séquençage subséquent.Pigliendu esperimenti NGS cum'è un esempiu, in l'esperimenti di teste RNA-Seq realizati nantu à a piattaforma Ion torrent™, a maiò parte di i campioni cù valori IQ più grande di 4 avianu almenu 50% di lettura efficace (Figura 5).In cunfrontu cù i metudi di rilevazione sopra citati, Qubit IQ Assay ùn hè micca solu più convenientu per uperà è piglia menu tempu (in cinque minuti), ma hà ancu una grande correlazione trà u valore IQ di parametru misuratu è a qualità di dati di esperimenti downstream.

Figura 5, ci hè una grande correlazione trà u valore di Qubit RNA IQ è e letture mappate di RNA-Seq.【5】

Attraversu l'intruduzioni sopra, crede chì ognunu hà una capiscitura abbastanza di e diverse metudi di cuntrollu di qualità RNA.In pratica, pudete sceglieu metudu currispundenti secondu u tipu di mostra è strumenti esistenti.Solu cuntrullà a qualità di l'RNA bè pudemu evità u fallimentu di l'esperimenti successivi causati da una qualità di mostra povera, risparmiendu cusì preziosu tempu, energia è costu.

Prodotti di riferimentu:

Kit d'isolazione di l'RNA tutale di l'animali

Kit d'isolement d'ARN total cellulaire

riferimenti

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: un numeru di integrità di RNA per l'assignazione di valori di integrità à e misurazioni di RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, August Issue, Pagina 273192https://doi.org/10.1093/toxsci/