L'esperimentu RT-qPCR include l'estrazione di l'RNA è a valutazione di a qualità, a trascrizione inversa è qPCR trè passi, ogni passu hà assai precauzioni, avemu da presentà in dettagliu quì sottu.

Ⅰ.Valutazione di a qualità di l'RNA

In l'esperimentu RT-qPCR, dopu à a fine di l'estrazione di RNA, a qualità di l'RNA deve esse evaluata, è l'esperimentu di seguitu pò esse realizatu solu dopu avè qualificatu.I metudi di valutazione includenu u spettrofotometru, l'elettroforesi di gel Agilent, l'analisi Agilent 2100, trà i quali u spettrofotometru più cumuni è a rilevazione di u metudu di l'elettroforesi di gel d'agarose.Semu devi esse nutatu chì sti dui metudi anu da esse usatu inseme per compie a deteczione è l'analisi di a cuncentrazione di l'RNA, a purità è l'integrità, per assicurà a qualità di l'RNA.

Kit d'isolazione di RNA in relazione: 

Kit d'isolement d'ARN total cellulaire

L'RNA tutale altamente purificatu è di alta qualità pò esse ottenutu da diverse cellule cultivate in 11 min.

Kit d'isolazione di l'RNA tutale di l'animali

Estrae rapidamente è efficacemente l'RNA tutale di alta purezza è di alta qualità da diversi tessuti animali.

Spectrofotometru:

U spettrofotometru hè principalmente usatu per determinà a cuncentrazione è a purità di l'RNA, ma ùn pò micca detectà l'integrità di l'RNA è u residu genomicu.Frà elli, A260/280 è A260/230 sò parametri impurtanti per a rilevazione di purità di RNA, è a purità di l'RNA pò esse rilevata secondu a fluttuazione di i so valori:

1. 1.9 < A260 / 280 < 2.1, chì indica chì a purità di l'RNA hè bona;A260/280 <1.9, chì indica chì ci pò esse residu di proteina in RNA;A260 / 280> 2.1, chì indica una putenziale degradazione parziale di l'RNA, chì pò esse ulteriormente cunfirmata da l'elettroforesi di gel d'agarose.

2. 2.0 < A260 / 230 < 2.2, chì indica chì a purità di l'RNA hè bona;A260/230 < 2.0, chì indica chì ci ponu esse residui di reagenti organici in RNA, cum'è fenoli, etanol o zuccheri.

Elettroforesi in gel d'agarose:

L'analisi di l'elettroforesi in gel d'agarose pò analizà l'integrità di l'RNA, u genoma è i residui di prutezione, ma ùn pò micca quantificà accuratamente a cuncentrazione di RNA o detectà i residui di reagenti organici.Pigliate mudelli di RNA eucarioti per esempiu:

1. L'RNA hè sottumessu à l'elettroforesi di gel d'agarose.S'ellu ci era solu trè bande uniche di 28sRNA, 18sRNA è 5.8sRNA nantu à a mappa di gel, indica chì l'RNA estratto hè intactu.Se ci hè un fenomenu di trascinamentu, indica una degradazione parziale di l'RNA.

2. Se ci hè una sola banda luminosa trà u pirtusu di cola è a banda 28sRNA, pò esse un residu di DNA genomicu.

3. Se i bandi appariscenu in u pirtusu di cola, indica chì ci ponu esse residui di prutezione è altre sustanzi macromolecular.

Ⅱ. Trascrizione inversa

Dopu chì l'estrazione di RNA hè finita, deve esse invertitu in cDNA per esperimenti successivi, cusì u passu di inversione hè essenziale.A trascrizione inversa sarà introdotta da a selezione di trascrittasi inversa e primer:

Selezzione di transcriptase inversa:

I trascriptasi inversi tipici includenu AMV RTase è MMLV RTase.A RNase H di AMV RTase hà una forte attività, una breve durata di sintesi, una bassa quantità di sintesi è una bona stabilità termica (42 ~ 55 ℃).L'attività RNase H di MMLV RTase hè debule, a durata di sintesi hè longa, a quantità di sintesi hè alta, è a stabilità termica hè povera (37 ~ 42 ℃).

Perchè l'enzima RNase H hà a funzione di degradazione di u mudellu di RNA, MMLV cù una attività RNase H debule deve esse sceltu preferenzialmente durante a trascrizzione inversa, è dopu l'ingegneria genetica più tardi, a stabilità termica di MMLV hà righjuntu un salto qualitatiu.Piglià ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV per a trascrizione inversa) cum'è un esempiu, hè una nova transcriptase inversa espressa in bacteria ingegneria di E. coli cù a tecnulugia di recombinazione genetica.Hè una DNA polimerasi recombinante chì sintetizza un filamentu di DNA cumplementari da RNA, DNA, o un hibridu RNA:DNA monocatena.Ùn hà micca attività RNase H, forte stabilità, forte affinità RNA, è alta sensibilità di rilevazione.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV per a trascrizione inversa)

Scelta di prima:

In generale, i primers RT sò in trè categurie: oligo dT, primers random, è primers gene-specific.Sceglite primers adatti per l'usu secondu e diverse esigenze sperimentali.

1. Se u mudellu hè di origine eucariotica è u cDNA tardiu hè utilizatu per l'amplificazione di PCR di rutina, Oligo (dT) hè cunsigliatu;Se l'esperimentu sussegwente hè solu utilizatu per qPCR, Oligo (dT) hè cunsigliatu per esse mischju cù primers aleatoriu per migliurà l'efficienza di a trascrizione inversa.

2. Se u mudellu hè di procarioti, Primi aleatoriu o primers specifichi di genu deve esse sceltu per a trascrizzione inversa.

Ⅲ.qPCR

A quantificazione di fluorescenza hè principalmente elaborata da a selezzione di metudi quantitativi, principii di cuncepimentu di primer, selezzione ROX, cunfigurazione di u sistema di reazione è cunfigurazione di e cundizioni di reazione, etc.

Selezzione di metudi quantitativi:

I metudi quantitativi sò spartuti in metudi quantitativi relative è metudi quantitativi assoluti.A quantificazione relativa pò esse aduprata per detectà l'effettu di certi metudi di trattamentu nantu à l'espressione genica, detectà a diffarenza di l'espressione genica in tempi diversi è paragunate a diferenza di l'espressione genica in diversi tessuti.A quantificazione assoluta pò detectà a quantità di l'acidu nucleicu in u virus è cusì.Quandu si facenu esperimenti, duvemu sceglie i metudi quantitativi adattati secondu i nostri esperimenti.

Principi di cuncepimentu di primura:

U disignu di primer per qPCR hè direttamente ligatu à l'efficienza di amplificazione è a specificità di u produttu.Dunque, cuncepimentu currettamente di boni primers hè u primu passu di qPCR successu.In u disignu di primer, i seguenti principii devenu esse attenti à quandu si scontra u principiu di u disignu di primer cunvinziunali:

1. A durata di u fragmentu di destinazione hè cuntrullata trà 100 è 300 bp;

2. Disegnu cross-exon per evità l'influenza di l'ADN genomicu;

3. I primi disignati devenu esse pruvati per l'efficienza di amplificazione, è solu quandu l'efficienza di amplificazione righjunghji u standard (90-110%) ponu esse usatu per esperimenti quantitativi;

4. A cuncentrazione di Primer hè di solitu ottimizzata trà 0.1uM è 1.0uM.

Selezzione diROX:

In u prucessu di reazione quantitativa, ROX pò aghjustà a diferenza di u percorsu otticu, l'errore di pipetting o a differenza di volume causata da l'evaporazione è a condensazione uniformemente, migliurà a ripetibilità di i risultati.Tuttavia, deve esse nutatu chì a selezzione di ROX hè ligata à u strumentu.Se l'instrumentu qPCR hà a funzione di corregge automaticamente a diffarenza trà i buchi, ùn hà micca bisognu di aghjunghje ROX;altrimenti, ci vole à aghjunghje a correzione ROX.I picculi partenarii in l'acquistu di reagenti deve esse secondu l'instrumentu utilizatu per sceglie u ROX currettu, evitendu errori dopu.

Preparazione di u sistema di reazzione:

I volumi di reazione di 20ul è 50ul sò preferiti.Quandu u sistema hè formulatu, deve esse attentu à e seguenti cose:

1. U sistema di reazione deve esse preparatu da a ventilazione in u workbench ultra-clean, novu ddH₂O hè utilizatu per ogni esperimentu;

2. Ogni esperimentu hà bisognu di priparà NTC per verificà s'ellu ci hè a contaminazione in u sistema, è ogni paru di prima deve fà NTC quandu preparanu u sistema;

3. Per detectà s'ellu ci hè residu di gDNA in u mudellu RNA, NRT pò esse preparatu per ogni mostra per a deteczione;

4. Quandu preparanu u sistema, hè cunsigliatu di fà almenu 3 ripetizioni tecniche per una mostra;

5. Quandu u mudellu hè cDNA, hè cunsigliatu di dilute 5-10 volte per riduce l'effettu di inhibizione di u sistema di trascrizzione inversa nantu à l'esperimentu qPCR.Hè megliu per scopra a quantità di mudellu per gradiente, perchè u valore CT casca trà 20-30;

6. Determinà u nùmeru necessariu di reazzione, cresce da 5-10% nantu à a basa di u numeru di reazzioni, è calculate u numeru di cunfigurazione di u voluminu;

7, u sistema hè preparatu cù u principiu di premix, mischjendu dopu a centrifugazione è assicuratevi senza bolle;

8, In quantu pussibule di sceglie i consumabili di supportu.

Kit RT-qPCR in relazione