Specificità di a deteczione
In a maiò parte di i casi, u scopu di u primu disignu hè di maximizà a specificità di a PCR.Questu hè determinatu da l'influenza più o menu prevedibile di parechje variàbili.Una variabile impurtante hè a sequenza à l'estremità 3' di u primer.
Impurtante, i saggi PCR cuncepiti per a specificità sò più prubabile di mantene una alta efficienza in una larga gamma dinamica, perchè l'assay ùn pruduce micca prudutti di amplificazione non specifichi, cuncurrendu cusì cù reagenti PCR o inibendu a reazione di amplificazione principale.
Di sicuru, in certi casi, a specificità ùn hè micca u più impurtante, per esempiu, quandu l'ughjettu hè di quantificà i patogeni strettamente ligati, ma diversi, sò richiesti standard di cuncepimentu speciale, ottimisazione è verificazione.
A curva di fusione hè un metudu standard per valutà a specificità di l'ampliconi, almenu in quantu à amplifificà un unicu mira.In ogni casu, deve esse enfatizatu chì e curve di fusione ponu esse ingannevoli perchè, per esempiu, ponu esse affettati da l'effetti cumminati di primers suboptimali è cuncentrazioni di mudelli bassi.
P5 |A curva di fusione mostra i cambiamenti Tm ottenuti da duie rilevazioni di quantità diverse di dui DNA di destinazione.
A. À cuncintrazioni più altu (ad)), ùn ci hè micca un dimeru di prima evidente dopu chì a misurazione qPCR hè cumpletata.Quandu a cuncentrazione di u mudellu diminuite à 50 copie (e), un pruduttu micca specificu cumencia à apparisce è diventa l'unicu pruduttu à a concentrazione più bassa (f).
B. A prova hà registratu u listessu Tms à tutte e cuncentrazione di destinazione, è ùn ci era micca un dimeru di prima evidente ancu à a cuncentrazione più bassu (copii 5).Quandu si usanu sti dui metudi di rilevazione, ùn sò stati rilevati micca prudutti di amplificazione in NTC.
P5 mostra e curve di dissoluzione ottenute cù campioni in quale u mudellu hè presente à diverse cuncentrazioni.P 5a mostra chì à i dui cuncintrazioni più bassu, i Tms di i prudutti di amplificazione non specifichi pruduciutu sò più bassi di quelli di l'amplicons specifichi.
Ovviamente, stu metudu di rilevazione ùn pò micca esse utilizatu in modu affidabile per detectà miri chì esistenu in cuncentrazioni bassu.
Curiosamente, NTC, vale à dì, campioni senza DNA in tuttu, ùn anu micca registratu i prudutti di amplificazione (non specifichi), chì indicanu chì l'ADN genomicu di fondo pò participà à amplificazione / polimerizazione non specifica.
A volte, tali primers di fondo è l'amplificazione non specifica ùn ponu esse rimediate, ma hè spessu pussibule di disignà un metudu di deteczione chì ùn hà micca amplificazione non specifica in ogni cuncentrazione di mudellu è NTC (P 5b).
Quì, ancu registrà l'amplificazione di a concentrazione di destinazione cù un Cq di 35 pruducerà una curva di dissoluzione specifica.De même, les NTC n'ont montré aucun signe d'amplification non spécifique.Calchì volta, u cumpurtamentu di deteczione pò esse dipende di u licore madre, è solu l'amplificazione non-specificu hè rilevatu in certi cumpusizioni buffer, chì pò esse ligata à differente cuncentrazione Mg2 +.
Stabilità di deteczione
L'ottimisazione di Ta hè un passu utile in u prucessu di verificazione empirica è ottimisazione di a rilevazione qPCR.Il fournit une indication directe de la robustesse du jeu d'amorces en indiquant la température (ou l'intervalle de température) qui produit le Cq le plus bas sans amplifier le NTC.
A diferenza da dui à quattru volte in a sensibilità pò esse micca impurtante per e persone cù una alta espressione di mRNA, ma per i testi diagnostichi, pò significà a diffarenza trà risultati pusitivi è falsi negativi.
E proprietà Ta di i primers qPCR pò varià assai.Certi testi ùn sò micca assai robusti, è s'ellu ùn sò micca realizati sottu u valore ottimali Ta di i primers, colapsanu rapidamente.
Questu hè impurtante perchè stu tipu di deteczione hè spessu problematicu in u mondu reale, è a purità di a mostra, a cuncentrazione di l'ADN, o a presenza di l'altru DNA pò esse micca ottimali.
Inoltre, u numeru di copia di destinazione pò varià in una larga gamma, è i reagenti, utensili di plastica, o strumenti ponu esse sfarenti di quelli utilizati quandu si stallanu a prova.
P6|U gradiente di temperatura mostra a diversa robustezza di a rilevazione PCR.
A. Aduprate u Mastermix Sensifast SYBR di Bioline (numeru di catalogu BIO-98050) per realizà PCR nantu à cDNA preparatu da RNA di u cervellu umanu.
B. Aduprà l'instrumentu CFX qPCR di Bio-Rad per registrà a mappa di amplificazione è a curva di dissoluzione di l'apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCCTAGG).
C. Graficu di amplificazione è curva di fusione di ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Graficu di amplificazione è curva di dissoluzione di GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs arregistrata à differente temperature annealing, chì mostra a diffarenza in Cq arregistrata sottu à un gradient temperature 7C.
P 6 mostra un risultatu tipicu di una prova indesiderata, induve qPCR hè stata realizata utilizendu un gradiente Tas trà 59C è 67C (P 6a), utilizendu primers per trè geni specifichi di u cervellu umanu.
Pò esse vistu da u gràficu di amplificazione chì i primers Opalin sò luntanu da l'ideale perchè u so intervallu ottimale Ta hè assai strettu (Figura 6b), vale à dì, Cqs sò largamente dispersi, risultatu in Cqs esse significativamente paragunatu à i so Cqs Low ottimali.
Stu metudu di deteczione hè inestabile è pò purtà à amplificazione subottimali.Per quessa, stu paru di primers deve esse redesignatu.Inoltre, l'analisi di a curva di fusione (inseritu) mostra chì a specificità di stu metudu di rilevazione pò ancu esse problematica, perchè a curva di fusione di ogni Ta hè diversa.
U metudu di deteczione ACSBG1 mostratu in P 6c hè più robustu chì u metudu di deteczione Opalin sopra, ma hè sempre luntanu da l'ideale, è hè prubabile chì pò esse migliuratu.
In ogni casu, avemu enfatizatu chì ùn ci hè micca una cunnessione necessaria trà robustezza è specificità, perchè a curva di dissoluzione prodotta da stu metudu di rilevazione mostra u listessu valore di piccu in tutti i Tas (inseritu).
Per d 'altra banda, a prova di robustezza hè assai più tollerante, pruducendu Cqs simili in una larga gamma di Tas, cum'è in a prova GFAP mostrata in P 6d.
A diffarenza in Cqs ottenuta in u stessu intervallu di 8 gradi Celsius hè menu di 1, è a curva di dissoluzione (inseritu) cunfirma e caratteristiche di deteczione in questa gamma di temperatura.Hè da nutà chì u Tas calculatu è l'intervallu Ta reale pò esse assai diffirenti.
Ci hè parechje linee guida pensate per aiutà i circadori à cuncepisce i primi efficaci, a maiò parte di quali sò basati nantu à e regule stabilite longu è assai attente hè stata pagata à u 3'end of the primers.Hè spessu ricumandemu per include un G o C à l'estremità 3' è dui basi G o C (GC clamp), ma micca più di dui di l'ultimi 5 basi.
In pràtica, sti règuli ponu guidà i circadori, ma ùn sò micca necessariamente curretti in ogni circustanza.
P7 |U 3'end di u primu hà pocu effettu nantu à specificità o efficienza.
A. A pusizione di i primi per u genu HIF-1α umanu (NM_181054.2).
B. Aduprà Agilent Brilliant III SYBR Green liquore madre (Cat. No. 600882) per amplify six items test.
C. Graficu di amplificazione è curve di fusione arregistrata da u strumentu CFX qPCR di Bio-Rad è primers 3′end.I NTC sò mostrati in rossu.
D. Cqs record di ogni articulu di prova
Per esempiu, u risultatu in P 7 cuntradisce a regula 3'end.Tutti i disinni pruduceranu basicamente i stessi risultati, cù solu duie combinazioni di primer chì portanu à l'amplificazione non specifica in NTC.
In ogni casu, ùn pudemu micca sustene l'effettu di u clip GC, perchè in questu casu, usendu A o T cum'è un massimu di basi 30 ùn riduce micca a specificità.
Test C, induve u primer F finisce in GGCC, hà registratu Cqs in NTC, chì indica chì unu puderia vulerà evità sti sequenze à a fine 30.Enfatigemu chì l'unicu modu per determinà a megliu sequenza 3'end di un paru di primer hè di valutà certi primers candidati sperimentalmente.
Efficienza di amplificazione
Hè impurtante, ancu se a rilevazione di PCR non specifica ùn pò mai diventà specifica, l'efficienza di amplificazione pò esse aghjustata è maximizata in parechje manere diverse cambiendu l'enzima, u licore madre, l'additivi è e cundizioni di ciclismo.
Per evaluà l'efficienza di a deteczione di PCR, hè megliu aduprà una diluzione seriale di 10 o 5 volte l'acidu nucleicu di destinazione, vale à dì u "metudu di curva standard".
Se l'ampliconi PCR o l'ughjetti di DNA sinteticu sò usati per generà una curva standard, diluzioni seriali di sti miri sò mischiati cù una quantità constante di DNA di fondo (cum'è DNA genomicu).
P8 |Curva di diluzione per evaluà l'efficienza di a PCR.
A. Aduprate primers per HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA è R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC è Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (numeru di catalogu 600882) per PCR è cundizioni di curve di fusione.
B. 100 ng RNA hè stata trascritta in reverse, diluted 2 times, è serially diluted cDNA samples were diluted 5 times to 1 ng human genomic DNA.A curva di fusione hè mostrata in l'inseritu.
C. A reazione RT, a diluzione è a diluzione seriale sò state ripetute per a seconda mostra di cDNA, è i risultati eranu simili.
P 8 mostra dui curve standard, cù u listessu mètudu dittizzioni nant'à dui campioni cDNA differente, u risultatu hè a stessa efficienza, circa 100%, è u valore R2 hè dinù simile, vale à dì, u gradu di fit trà i dati spirimintali è a linea di regressione o di i dati Gradu di linearità.
E duie curve standard sò paragunabili, ma micca esattamente listessi.Se u scopu hè di quantificà accuratamente u target, deve esse nutatu chì hè inacceptable per furnisce un calculu di numeru di copia senza spiegà l'incertezza.
P9 |Incertezza di misurazione assuciata à a quantificazione cù una curva standard.
A. Aduprate primers per GAPDH (NM_002046) per fà PCR è e cundizioni di curve di fusione.F: ACAGTTGCCATGTAGACC è R: TAACTGGTTGAGCACAGG è Mastermix Sensifast SYBR di Bioline (numeru di catalogu BIO-98050).
B. Carta di amplificazione, curva di fusione è curva standard registrata cù l'instrumentu CFX qPCR di Bio-Rad.
C. Graficu di curva standard è intervallu di cunfidenza 95% (CI).
D. U numaru di copia è l'intervallu di cunfidenza 95% di i trè valori Cq derivati da a curva di diluzione.
P 9 mostra chì per una prova ottimizzata, a variabilità inherente di una sola curva standard hè di circa 2 volte (intervallu di cunfidenza 95%, minimu à massimu), chì pò esse a variabilità più chjuca chì pò esse aspittatu.
Pruduttu in relazione:
Tempu di post: 30-Sep-2021
