RNase hè una parolla sensitiva chì parechji studienti chì spessu realizanu esperimenti di estrazione di RNA ùn volenu micca sente.Completamente armatu, l'RNA chì hè stata finalmente estratta cù i reagenti altamente tossichi fenol è cloroformu hè statu degradatu.Ùn sò micca cunciliatu !!!Oghje, fighjemu un ochju à l'origine di a famosa Rnase.

A ribonucleasi (RNase), o RNase, hè una nuclease chì pò idrolizà l'RNA in molécule petite.A RNase, cum'è una piccula proteina di molécula, hè inusualmente stabile .L'inhibitori di a proteina è l'inhibitori di a proteina ùn ponu micca inattivà completamente.A stabilità di RNase vene principalmente da i ligami disulfuri in a struttura.Per esempiu, a RNase comunmente usata di u pancreas bovinu hà solu 124 aminoacidi, ma cuntene 4 ligami disulfide.U legame sulfuru è u legame disulfuru dotate à a RNase una stabilità termica eccellente.Inoltre, a rnase hà un pesu molekulari relativamente chjucu è pò restaurà rapidamente a so conformazione originale in parechji casi.

In più di esse estremamente stabile,I RNases sò omnipresenti in u laboratoriu .RNase hè un mecanismu di difesa biologica.Per una cellula, l'RNA esogenu hè spessu fatale.Comparatu cù l'ADN esogenu, l'RNA esogenu hè spessu più periculosu.L'RNA hè felicemente trascrittu è traduttu, cusì quasi tutti l'organisimi anu evolutu RNases per difende contru l'invasione di RNA esogenu.Dunque, e cellule batteriche cultivate in u laboratoriu è voi chì estratti l'RNA exude l'aroma di RNase.I fluidi di u corpu umanu (saliva, lacrime, etc.) cuntenenu una grande quantità di RNase, perchè ùn pienghje micca quandu l'RNA hè degradatu.Più pienghje, più peghju hè a degradazione di l'RNA !!Sister Daiyu ùn hè micca adattatu per l'estrazione di RNA!

Inoltre, a vostra pelle dilicata cuntene ancu assai RNase, è i marcatori, pipette, porte di frigoriferi è manichi di porta chì anu toccu da a pelle cuntenenu ancu RNase.

Cù tanta divagazione, fighjemu un ochju à cumu trattà cù RNases.

A prima cosa chì tutti pensanu quandu sguassate l'RNA hèDEPC(pirocarbonate di dietilu).DEPC denatura principalmente a proteina cumminendu cù l'anellu imidazole di u gruppu attivu RNase histidine, inibendu cusì l'attività di l'enzima.0.1% DEPC pò avè un effettu rimuzzioni megliu nant'à Rnase, ma avemu bisognu di attente chì DEPC hè un carcinogenu cunnisciutu, cusì una attenzione particulari deve esse pagatu quandu si usa.

Per RNase, avemu da principià da dui aspetti,u primu hè di inibisce l'attività di RNase endogene

I reagenti di l'estrazione di RNA cunvinziunali, cum'è l'isotiocianatu di guanidine è u DTT cuntenuti in Trizol, ponu apre u ligame disulfuru di RNase, ma ci sò ancu qualchi RNases, soprattuttu in campioni di tissuti, cusì fate attente à a bassa temperatura.

1.Immediatamente immerse a mostra di tissutu in nitrogenu liquidu dopu avè pigliatu, o in una suluzione cummerciale di preservazione di RNA.

2.Dopu avè estratto l'ARN di a mostra di cellula, aghjunghje à a suluzione di lisi è lise nantu à a scatula di ghiaccio.

3. Hè megliu aduprà nitrogenu liquidu per a macinazione quandu i campioni di tissuti sò homogeneizzati.Quandu s'utilice un omogenizatore elettricu senza nitrogenu liquidu, fate attenzione à u pre-cooling cumpletu di l'adattatore homogenate.

U sicondu hè DNase esogenu

1.Siate armati cumplettamente, portate un mantellu di labburatoriu, portate una maschera, è assicuratevi di portà un paru di guanti novi (ùn siate micca cusì risparmiu !! Ci vole à nutà chì Trizol hè super corrosive, è hè ancu assai forte attraversu i guanti, perchè ùn gocce micca nantu à e vostre mani).

2.Tutti i puntali di pipette, i tubi EP, i tubi PCR è l'altri equipaggiamenti usati devenu esse trattati cù de-RNase.Pò esse imbulighjate in 0,1% DEPC è poi pressurized sottu pressione alta.Prestate attenzione à l'operazione in una cappa di fume.I tirani lucali ponu cumprà direttamente consumabili per sguassà l'enzimi.

PS: Lasciami dicu un metudu pigro.Ancu l'alta temperatura è l'alta pressione ùn ponu micca eliminà completamente a RNase, caccià una grande parte di questu.2 volte di alta temperatura è alta pressione hà un bonu effettu, è l'estrazione di RNA hà pocu effettu.

3.L'alcolu pò denature i proteini,cusì a tavola d'estrazione di RNA pò esse sguassata cù 75% alcolu , è i guanti ponu ancu esse sprayed with alcohol.

4.A suluzione finale di dissoluzione di l'RNA è u tubu di centrifuga deve ancu esse trattatu de-RNase.L'acqua DEPC hè una suluzione di dissoluzione di RNA cumunimenti usata.Parlemu di u metudu di preparazione curretta di l'acqua DEPC (ricurdatevi di ricuperà u DEPC cummerciale quandu avete acquistatu)

Aghjunghjite DEPC à l'acqua ultrapura à 1: 1000, scuzzulate bè, lasciate per a notte à 37 ° C, è sterilizà à 121 ° C à alta temperatura è alta pressione per 15 minuti.L'acqua DEPC pò esse guardata à -20 ° C in aliquots 1ml.

Infine, per riassume: a bassa temperatura hè a chjave, i consumabili sò trattati bè, armati cumplettamente è menu parlà !

Ebbè, hè questu per a strategia d'oghje.Ti pregu tutta a cuncentrazione di l'RNA è a purità chì avete citatu.I dui A260 / A280 sò 2.0!!!

Di sicuru, se utilizate aKit d'estrazione di RNA per u funziunamentu di a temperatura di l'ambienti, ùn pudete micca scuntrà i prublemi sopra.

L'operazione à a temperatura di l'ambienti, senza aghjunghje DNase, estrae l'ARN tutale da e cellule in 11 minuti, è estrae l'RNA tutale da i tessuti animali o piante in 30 minuti.

Per i campioni di prova, cuntattate:overseas@foregene.com

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