Base di cuncepimentu di primu (99% di i prublemi ponu esse risolti)

1. Lunghezza di prima: U libru di testu richiede 15-30bp, di solitu circa 20bp.A cundizione attuale hè megliu esse 18-24bp per assicurà a specificità, ma u più longu u megliu, troppu longu prima ancu riducerà a specificità, è riduce u rendiment.

2. Prima amplification span: 200-500bp hè apprupriatu, è u fragmentu pò esse allargatu à 10kb in cundizioni specifichi.

3. Base Primer: U cuntenutu di G + C deve esse 40-60%, troppu pocu effettu amplification G + C ùn hè micca bonu, troppu G + C hè facile à cumparisce bandi non-specific.ATGC hè megliu distribuitu aleatoriamente, evitendu clusters di più di 5 nucleotidi purini o pirimidini.Multi-gc per l'estremità 5' è e sequenze intermedie per aumentà a stabilità, evitendu GC riccu à l'estremità 3', senza GC per l'ultimi basi 3, o senza GC per 3 di l'ultimi basi 5.

4. Evite struttura secundaria in primers, è evitari cumplementazioni trà dui primers, in particulare cumplementarii à u 3 'fine, altrimenti dimer prima sarà furmatu è bandi amplified non-specificu sarà generatu.

5. I basi à u 3 'fine di primers, soprattuttu l 'ultimu è penultimu basi, deve esse strettu paired à evitari fallimentu PCR a causa di basi terminal unpaired.

6. Primers anu o ponu esse aghjuntu cù siti di clivature appropritatu, è a sequenza di destinazione amplificata deve preferibilmente avè i siti di clivaggio adattati, chì hè assai benefica per l'analisi di cleavage o clonazione moleculare.

7. Specificità di i primers: i primers ùn anu micca un omologia evidenti cù altre sequenze in a basa di dati di sequenza di l'acidu nucleicu.

8. Amparate à utilizà u software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Stu disignu in linea funziona megliu).

U cuntenutu di sopra pò risolve almenu 99% di i prublemi di cuncepimentu di prima.

Cuntrolla i dettagli di u disignu di u primu

1. Prima lunghezza

A lunghezza di prima generale hè 18 ~ 30 basi.In generale, u fattore più impurtante chì determina a temperatura di annealing di u primer hè a durata di u primer.A temperatura di annealing di primer hè generalmente sceltu (valore Tm -5 ℃), è certi utilizanu direttamente u valore Tm.E formule seguenti ponu esse aduprate per calculà approssimativamente a temperatura di annealing di primers.

Quandu a durata di prima hè menu di 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

Quandu a durata di primer hè più grande di 20bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (% GC) -500 / lunghezza-5 ℃

Inoltre, assai software pò ancu esse usatu per calculà a temperatura di l'anneling, u principiu di calculu serà diversu, perchè qualchì volta u valore calculatu pò avè un picculu spaziu.Per ottimisà e reazzioni di PCR, i primers più brevi chì assicuranu temperature di annealing di micca menu di 54 ℃ sò usati per a megliu efficienza è specificità.

In generale, a specificità di primer aumenta da un fattore di quattru per ogni nucleotide supplementu, cusì chì a lunghezza minima di primer per a maiò parte di l'applicazioni hè 18 nucleotides.U limitu superiore di a lunghezza di prima ùn hè micca assai impurtante, principarmenti in relazione à l'efficienza di a reazione.A causa di l'entropia, più longu hè u primer, u più bassu hè u ritmu à quale annealing per ligà à l'ADN di destinazione per furmà un mudellu stabile à doppia fila per a DNA polimerasi per ligà.

Quandu s'utilice u software per cuncepisce i primers, a durata di i primers pò esse determinata da u valore TM à u turnu, soprattuttu per i primers di PCR quantitativa di fluorescenza, TM = 60 ℃ o più deve esse cuntrullata.

2.GC cuntenutu

In generale, u cuntenutu di G + C in sequenze di primer hè 40% ~ 60%, è u cuntenutu GC è u valore Tm di un paru di primer deve esse coordinatu.Se u primer hà una seria tendenza GC o AT, quantità approprita di A, T o G è C coda pò esse aghjuntu à l'estremità 5 'di u primer.

3. Temperature anneling

A temperatura di annealing deve esse 5 ℃ più bassu di a temperatura di unchain.Se u numeru di basi di prima hè chjuca, a temperatura di annealing pò esse aumentata in modu adattatu, chì pò aumentà a specificità di a PCR.Se u numeru di basi hè grande, a temperatura di annealing pò esse ridutta in modu adattatu.La différence de température de recuit entre un couple d'amorces de 4℃ ~ 6℃ n'affectera pas le rendement de la PCR, mais idéalement la température de recuit d'un couple d'amorces est la même, qui peut varier entre 55℃ et 75℃.

4. Evite l'area di struttura secundaria di u mudellu di amplificazione

Hè megliu per evità a regione di struttura secundaria di u mudellu quandu selezziunate u fragmentu amplificatu.A struttura secundaria stabile di u frammentu di destinazione pò esse prevista è stimata da u software pertinenti di l'informatica, chì hè utile per a selezzione di mudelli.I risultati spirimintali dimustranu chì l'espansione hè spessu senza successu quandu l'energia libera (△G) di a regione per esse allargata hè menu di 58.6lkJ/mol.

5. Mismatch with target DNA

Quandu a sequenza di DNA di destinazione amplificata hè grande, un primer pò unisce à parechje parti di l'ADN di destinazione, risultandu in parechje bande chì appariscenu in u risultatu.Questa volta hè necessariu di utilizà a prova di u software BLAST, situ web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Selezziunate Alline two sequences (bl2seq).

Incolla e sequenze di primer à a zona 1 è e sequenze di DNA di destinazione in a zona 2 hè intercambiabile, è BLAST calcula cumplementari, antisensu è altre pussibulità, cusì l'utilizatori ùn anu micca bisognu di avvistà se e duie catene sò catene di sensu.Pudete ancu inserisce u numeru GI si cunnosci u numeru GI di a sequenza in a basa di dati, perchè ùn avete micca incollà una grande sezione di a sequenza.Infine, cliccate Align at 3 per vede se u primer hà parechji siti omologu in u DNA di destinazione.

6. Primer terminal

U 3 'fine di u primer hè induve l'estensione principia, per quessa, hè impurtante per prevene mistches da principià quì.L'estremità 3' ùn deve esse più di 3 G o C consecutivi, perchè questu pruvucarà u primer à esse attivatu per errore in a regione di sequenza di arricchimentu G + C.L'estremità 3' ùn pò micca formate alcuna struttura secundaria, eccettu in reazzioni PCR speciale (AS-PCR), l'estremità 3' di u primer ùn pò micca esse mistched.Per esempiu, s'è a regione di codificazione hè amplified, u 3 'fine di primer ùn deve esse finitu à a terza pusizioni di codon, perchè a terza pusizioni di codon hè propensu à degenerate, chì affettanu a specificità è l'efficienza di l'amplificazione.Quandu si usanu primers di annessione, riferite à a tabella di l'usu di codon, fate attenzione à a preferenza biologica, ùn utilizate micca i primeri di annessione à a fine 3', è utilizate una cuncintrazione più alta di primers (1uM-3uM).

7. Struttura secundaria di i primi

I primers stessi ùn anu micca avè sequenze cumplementarii, altrimente i primers stessi si piegheranu in strutture di hairpin, è sta struttura secundaria affettarà u ligame di primers è mudelli per via di l'impedimentu stericu.Se u ghjudiziu artificiale hè utilizatu, i basi cumplementarii cuntinui di i primi stessi ùn deve esse più grande di 3bp.Ùn deve esse micca cumplementarii trà i dui primers, in particulare a superposizione cumplementarii di l'estremità 3' deve esse evitata per impediscenu a furmazione di dimers primer.In generale, ùn deve esse micca più di 4 basi consecutivi omologia o cumplementarità trà un paru di primers.

8. Aghjunghjite marcatori o lochi

L'estremità 5' hà pocu effettu nantu à a specificità di amplificazione è pò dunque esse mudificata senza affettà a specificità di amplificazione.A mudificazione di primer 5 'end include: aghjunghjendu situ di restrizzione di l'enzyme;Biotina etichettata, fluorescenza, digossina, Eu3 +, ecc. Introduce sequenze di DNA di legame di proteine;Introducendu siti di mutazione, inserisce è mancanu sequenze di mutazione è introducendu sequenze di promotore, etc. I basi extra affettanu più o menu l'efficienza di l'amplificazione è aumentanu a chance di furmazione di prima dimeru, ma certi cuncessioni deve esse fatte per u prossimu passu.Sequenze supplementari chì ùn esistenu micca nantu à a sequenza di destinazione, cum'è siti di restrizzione è sequenze di promotore, ponu esse aghjuntu à l'estremità 5' di u primer senza affettà a specificità.Queste sequenze ùn sò micca incluse in u calculu di i valori di prima Tm, ma deve esse pruvatu per a cumplementarità è a struttura secundaria interna.

9. Subcloni

A maiò parte di u tempu, a PCR hè solu clonazione preliminare, è dopu avemu bisognu di subclone u fragmentu di destinazione in diversi vettori, cusì avemu bisognu di disignà basi supplementari per a prossima operazione in u passu PCR.

Alcune sequenze pensate per a subclonazione sò riassunte quì sottu.
U situ di restrizzioni di l'endonucleasi di restrizzioni hè statu aghjuntu

L'aghjunzione di siti di restrizzione enzimatica hè u metudu più cumunimenti utilizatu per a subclonazione di i prudutti PCR.Giniralmenti, u situ cleavage hè sei basi, in più di u 5 'fine di u situ cleavage bisognu di aghjunghje 2 ~ 3 basi prutittivu.In ogni casu, u numeru di basi protettive richieste da diverse enzimi hè diversu.Per esempiu, SalⅠ ùn deve micca una basa protettiva, EcoRⅤ richiede 1 basa protettiva, NotⅠ richiede 2 basi protettive, è Hind Ⅲ richiede 3 basi protettive.

LIC aghjusta a cuda

U nome cumpletu di LIC hè Ligation-Independent cloning, un metudu di clonazione inventatu da Navogen specificamente per a so parte di u vettore pET.U traspurtadore pET preparatu da u metudu LIC hà estremità sticky sticky 12-15 base non-complementary, chì cumplementanu l'estremità appiccicosa currispundenti nantu à u fragmentu di insertu di destinazione.Per scopi di amplificazione, a sequenza di primer 5' di u frammentu inseritu deve cumplementà u vettore LIC.L'attività extranect 3′→5′ di T4 DNA polimerasi pò furmà una sola fila appiccicosa in u fragmentu inseritu dopu à pocu tempu.Perchè u pruduttu pò esse furmatu solu da l'anneling mutuale di u fragmentu inseritu preparatu è u vettore, stu metudu hè assai veloce è efficace, è hè diretta clonazione.
Clone TA direttu aghjunghje coda
A clonazione TA ùn hè stata capace di destinà u frammentu in un vettore, cusì dopu Invitrogen hà introduttu un vettore chì puderia mira à a clonazione, chì cuntene quattru GTGGS di basa prominenti à una estremità.Per quessa, in u disignu di i primers PCR, sequenze cumplementarii deve esse aghjuntu in modu cusì, per chì i frammenti ponu esse "orientati".

Sè vo site pocu tempu, pudete pruvà a sintesi diretta, cumminendu u genu cù u vettore, chì hè ciò chì chjamemu a sintesi di u gene ET in i musculi.

D. Metudu di clonazione In-Fusion

Nisuna ligase necessaria, nè longa reazione necessaria.Sempre chì una sequenza à i dui estremità di u vettore linearizatu hè introduttu In u disignu di primers, allora u pruduttu PCR è u vettore linearizatu sò aghjuntu à a suluzione di l'enzyme in-fusion chì cuntene BSA è pusatu à a temperatura di l'ambienti per una meza ora, a trasfurmazioni pò esse realizatu.Stu metudu hè particularmente adattatu per a cunversione di grande volume.

10. Merge primer

A volte, solu l'infurmazione di sequenza limitata hè cunnisciuta nantu à u disignu di primer.Per esempiu, se solu a sequenza d'aminoacidu hè cunnisciuta, u primer di fusione pò esse designatu.Un primer di fusione hè una mistura di diverse sequenze chì rapprisentanu tutte e diverse pussibulità di basa chì codificanu un solu aminoacidu.Per aumentà a specificità, pudete riferite à a tavola d'usu di codon per riduce l'annessione secondu e preferenze d'usu di basa di diversi organismi.L'ipoxantina pò esse assuciata cù tutte e basi per riduce a temperatura di annealing di u primer.Ùn aduprate micca e basi annesse à l'estremità 3' di u primer perchè l'anneling di l'ultimi 3 basi à l'estremità 3' hè abbastanza per inizià a PCR in u situ sbagliatu.Concentrazioni di primer più elevate (1 μM à 3 μM) sò usate perchè i primers in parechje miscele d'annessione ùn sò micca specifichi à u mudellu di destinazione.

materie prime PCRcuntrollu

1. Prima quantità

A cuncentrazione di ogni primer hè 0.1 ~ 1umol o 10 ~ 100pmol.Hè megliu pruduce u risultatu necessariu cù a quantità minima di prima.L'alta concentrazione di primer pruvucarà una discordanza è amplificazione non specifica, è aumentanu a probabilità di furmà dimeri trà i primers.

2. Prima cuncentrazione

A cuncentrazione di primers afecta a specificità.La concentrazione ottimale di primer è generalmente tra 0,1 e 0,5 μM.A cuncentrazione di prima più altu porta à l'amplificazione di i prudutti non specifichi.

3. Temperature d'anneling di prima

Un altru paràmetru impurtante per i primers hè a temperatura di fusione (Tm).Questa hè a temperatura quandu u 50% di i primers è e sequenze cumplementarii sò rapprisentati cum'è molécule d'ADN à doppia catena.Tm hè necessariu per stabilisce a temperatura di recuit PCR.Ideale, a temperatura di annealing hè abbastanza bassa per assicurà un annealing efficace di i primers cù a sequenza di destinazione, ma abbastanza alta per riduce u ligame non specificu.Température de recuit raisonnable de 55 ℃ à 70 ℃.La température de recuit est généralement fixée à 5 ℃ inférieure à Tm du primer.

Ci sò parechje formule per stabilisce Tm, chì varienu assai sicondu a formula aduprata è a sequenza di primers.Perchè a maiò parte di e formule furnisce un valore Tm stimatu, tutte e temperature di annealing sò solu un puntu di partenza.A specificità pò esse migliurata analizendu parechje reazzioni chì aumentanu progressivamente a temperatura di annealing.Cumincià sottu à u Tm-5℃ stimatu, è cresce gradualmente a temperatura di annealing in un incrementu di 2℃.A temperatura di annealing più alta riducerà a furmazione di dimeri di prima è prudutti micca specifichi.Per i migliori risultati, i dui primers duveranu avè valori Tm apprussimati.Se a differenza Tm di coppie di primer hè più di 5 ℃, i primers mostraranu un falsu principiu significativu utilizendu una temperatura di annealing più bassa in u ciculu.Si les deux amorces Tm sont différentes, réglez la température de recuit à 5℃ plus basse que la Tm la plus basse.In alternativa, per aumentà a specificità, cinque ciculi ponu esse realizati prima à e temperature d'annealing pensate per un Tm più altu, seguitu da i ciculi rimanenti à e temperature di annealing cuncepiti per una Tm più bassa.Questu permette una copia parziale di u mudellu di destinazione per esse ottenuta in cundizioni strette.

4. Prima purità è stabilità

A purezza standard di i primers persunalizati hè adattatu per a maiò parte di l'applicazioni PCR.L'eliminazione di i gruppi benzoyl è isobutylyl da a desalatura hè minima è per quessa ùn interferiscenu micca cù a PCR.Alcune applicazioni necessitanu di purificazione per caccià ogni sequenza non-lunghezza in u prucessu di sintesi.Queste sequenze truncate accade perchè l'efficienza di a chimica di sintesi di DNA ùn hè micca 100%.Questu hè un prucessu circular chì usa reazzioni chimichi ripetuti cum'è ogni basa hè aghjuntu per fà DNA da 3′ à 5′.Pudete falla in ogni ciculu.Primi più longu, in particulare quelli più grande di 50 basi, anu una grande proporzione di sequenze truncate è ponu esse bisognu di purificazione.

U rendiment di primers hè affettatu da l'efficienza di a chimica sintetica è u metudu di purificazione.L'imprese biofarmaceutiche, cum'è Citologia è Shengong, usanu tutte una unità OD minima per assicurà a pruduzzioni tutale di oligonucleosidi.I primers persunalizati sò spediti in forma di polvere secca.Hè megliu per redissolve i primers in TE per chì a cuncentrazione finale hè 100μM.TE hè megliu cà l'acqua deionizzata perchè u pH di l'acqua hè spessu acidu è pruvucarà l'idrolisi di oligonucleosidi.

A stabilità di i primi depende di e cundizioni di almacenamiento.A polvera secca è i primers dissoluti deve esse guardatu à -20 ℃.Primers dissolute in TE à cuncintrazioni più grande di 10μM ponu esse almacenati in modu stabile à -20 ℃ per 6 mesi, ma ponu esse almacenati solu à a temperatura di l'ambienti (15 ℃ à 30 ℃) per menu di 1 settimana.I primers in polvere seccu ponu esse almacenati à -20 C per almenu 1 annu è à a temperatura di l'ambienti (15 C à 30 C) per un massimu di 2 mesi.

5. Enzymes è e so cuncentrazioni

Attualmente, l'ADN polimerasi Taq aduprata hè basicamente l'enzima di l'ingegneria genica sintetizzata da i batteri coliformi.A quantità di enzima necessaria per catalizà una reazione PCR tipica hè di circa 2.5U (si riferisce à u voluminu di reazione tutale di 100 ul).Se a cuncentrazione hè troppu alta, pò purtà à amplificazione non specifica;se a cuncentrazione hè troppu bassu, a quantità di pruduttu sinteticu serà ridutta.

6. Qualità è cuncentrazione di dNTP

A qualità di dNTP hè strettamente ligata à a cuncentrazione è l'efficienza di l'amplificazione PCR.U polveru dNTP hè granularu, è a so variabilità perde a so attività biologica s'ellu hè impropriamente guardatu.A suluzione dNTP hè acida, è deve esse usata in alta cuncentrazione, cù 1M NaOH o 1M Tris.HCL solu suluzione di buffer per aghjustà u so PH à 7.0 ~ 7.5, una piccula quantità di sub-packaging, almacenamentu congelatu à -20 ℃.Multiple congelazione-scongelu degraderà dNTP.In a reazione di PCR, dNTP deve esse 50 ~ 200 umol / L.In particulare, l'attenzione deve esse pagatu à a cuncentrazione di i quattru DNTPS deve esse uguali (preparazione mole uguale).Se a cuncentrazione di qualcunu d'elli hè sfarente di l'altri (più altu o più bassu), u misat hè causatu.A cuncentrazione troppu bassa riducerà u rendiment di i prudutti PCR.dNTP pò cumminà cù Mg2 + è riduce a cuncentrazione di Mg2 + liberu.

7. Template (genu di destinazione) àcitu nucleicu

A quantità è u gradu di purificazione di l'acidu nucleicu mudellu hè unu di i ligami chjave per u successu o fallimentu di a PCR.I metudi tradiziunali di purificazione di l'ADN generalmente utilizanu SDS è proteasi K per digerirà è dispunì specimens.E funzioni principali di SDS sò: dissolve lipidi è proteini nantu à a membrana cellulare, distrughjendu cusì a membrana di a cellula dissolundu e proteine ​​​​di a membrana, è dissociate e proteine ​​​​nucleari in a cellula, SDS pò ancu cumminà cù proteini è precipitate;A Protease K pò idrolizà è digerirà e proteine ​​​​, in particulare histones ligati cù l'ADN, è dopu aduprà fenoli di solventi organici è cloroformu per estrae proteine ​​​​è altri cumpunenti di e cellule, è utilizate etanol o alcolu isopropilico per precipitate l'acidu nucleicu.L'acidu nucleicu estratto pò esse usatu cum'è mudellu per reazzione PCR.Per i campioni di rilevazione clinica generale, un metudu rapidu è simplice pò esse usatu per dissolve e cellule, lisate i patogeni, digerisce è caccià e proteine ​​​​da i cromusomi per liberà i geni di destinazione, è direttamente utilizatu per l'amplificazione PCR.L'estrazione di mudelli di RNA generalmente usa guanidine isothiocyanate o u metudu di proteasi K per impedisce a RNase di degradare l'RNA.

8.Mg2 + cuncentrazione

Mg2 + hà un effettu significativu nantu à a specificità è u rendiment di l'amplificazione PCR.In generale, a reazione PCR, quandu a cuncentrazione di diversi dNTP hè 200umol / L, a cuncentrazione adatta di Mg2 + hè 1.5 ~ 2.0mmol / L.A cuncentrazione di Mg2 + hè troppu altu, a specificità di a reazione diminuisce, l'amplificazione non specifica si trova, a cuncentrazione troppu bassa riducerà l'attività di Taq DNA polymerase, risultatu in a riduzzione di i prudutti di reazione.

I ioni di magnesiu affettanu parechji aspetti di a PCR, cum'è l'attività di DNA polimerasi, chì affetta u rendiment;Un altru esempiu hè a prima annealing, chì afecta a specificità.dNTP è u mudellu si liganu à l'ione di magnesiu, riducendu a quantità di ioni di magnesiu liberu necessariu per l'attività enzimatica.A cuncentrazione ottimali di ioni di magnesiu varia per parechje coppie di primer è mudelli, ma una cuncentrazione tipica di PCR iniziale cù 200μM dNTP hè 1.5mM (nota: Per a PCR quantitativa in tempu reale, aduprate una soluzione di ioni di magnesiu da 3 à 5mM cù una sonda fluorescente).Cuncintrazioni più altu di ioni di magnesiu liberu aumentanu u rendiment, ma ancu aumentanu l'amplificazione non specifica è diminuite a fideltà.Per determinà a cuncentrazione ottima, i titrazioni di ioni di magnesiu sò stati realizati in incrementi di 0.5mM da 1mM à 3mM.Per riduce a dependenza di l'ottimisazione di ioni di magnesiu, Platinum Taq DNA polymerase pò esse usatu.Platinum Taq DNA polimerasi hè capaci di mantene a funzione nantu à una gamma più larga di concentrazioni di ioni di magnesiu cà Taq DNA polimerasi è per quessa richiede menu ottimisazione.

9. Pcr-promozione additivi

L'ottimisazione di a temperatura di annealing, u disignu di primer, è a cuncentrazione di ioni di magnesiu hè abbastanza per l'amplificazione altamente specifica di a maiò parte di mudelli;in ogni modu, certi mudelli, cumpresi quelli cù un altu cuntenutu di GC, necessitanu misure supplementari.L'additivi chì affettanu a temperatura di fusione di l'ADN furniscenu un altru modu per migliurà a specificità di u produttu è u rendiment.A denaturazione completa di u mudellu hè necessaria per i migliori risultati.

Inoltre, a struttura secundaria impedisce u ligame di primer è l'estensione di l'enzyme.

L'additivi di PCR, cumprese formamide, DMSO, glicerina, betaina è PCRx Enhancer Solution, aumentanu l'amplificazione.U so mekanismu pussibule hè di riduce a temperatura di fusione, aiutendu cusì à l'annealing di primers è assistendu l'estensione di l'ADN polimerasi attraversu a regione di a struttura secundaria.A Soluzione PCRx hà altri vantaghji.L'ottimisazione minima di ioni di magnesiu hè necessaria quandu si usa cù Platinum Taq DNA polimerasi è Platinum Pfx DNA polimerasi.Cusì, a tecnica Platinum hè cumminata cù l'additivu per aumentà a specificità mentre riduce a dependenza di u terzu approcciu, l'ottimisazione di ioni di magnesiu.Per u megliu risultati, a cuncentrazione di additivi deve esse ottimizzata, in particulare DMSO, formamide è glicerol, chì impediscenu Taq DNA polymerase.

 Foreasy Taq DNA Polymerase

10. Hot start

Hot start PCR hè unu di i metudi più impurtanti per migliurà a specificità di a PCR in più di un bon design primer.Ancu s'è a temperatura ottima di allungamentu di Taq DNA polimerasi hè 72 ℃, a polimerasi resta attiva à a temperatura di l'ambienti.Cusì, i prudutti micca specifichi sò pruduciuti quandu a temperatura di mantene hè più bassu di a temperatura di annealing durante a preparazione di a reazzione PCR è à u principiu di u ciclu termale.Una volta furmati, sti prudutti non specifichi sò effettivamente amplificati.A PCR Hot-start hè particularmente efficace quandu i siti utilizati per u disignu di u primu sò limitati da u locu di l'elementi genetichi, cum'è mutazioni dirette à u situ, clonazione di espressione, o custruzzione è manipulazione di elementi genetichi utilizati per l'ingegneria di DNA.

Un metudu cumuni per limità l'attività di Taq DNA polimerasi hè di preparà a suluzione di reazione PCR nantu à u ghjacciu è mette in un apparatu PCR preriscaldatu.Stu metudu hè simplice è prezzu, ma ùn cumpleta micca l'attività di l'enzyme è per quessa ùn elimina completamente l'amplificazione di i prudutti non specifichi.

L'priming termale ritarda a sintesi di DNA inibendu un cumpunente essenziale finu à chì l'apparechju PCR righjunghji a temperatura di denaturazione.A maiò parte di i metudi di iniziazione termale manuale, cumprese l'aggiunta ritardata di Taq DNA polimerasi, sò ingombranti, soprattuttu per l'applicazioni à altu rendiment.L'altri metudi di prima termale utilizanu un scudo di cera per aghjunghje un cumpunente essenziale, cumpresi ioni di magnesiu o enzimi, o per isolà fisicamente cumpunenti reattivi, cum'è mudelli è buffers.Duranti u ciculu termale, i diversi cumpunenti sò liberati è mischiati inseme mentre a cera si fonde.Cum'è u metudu manuale di partenza calda, u metudu di scudo di cera hè ingombrante è propensu à a contaminazione è ùn hè micca adattatu per l'applicazioni à altu rendiment.

L'ADN polimerasi di platinu hè cunvene è efficiente per a PCR automatica di partenza calda.Platinum Taq DNA polimerasi hè custituita da Taq DNA polimerasi ricombinante cumminata cù anticorpi monoclonali contra Taq DNA polimerasi.L'anticorpi sò formulati da PCR per inibisce l'attività enzimatica durante a temperatura prolongata.Taq DNA polimerasi hè stata liberata in a reazione durante l'insulazione di 94 ℃ di u passu di denaturazione, ristabilisce a piena attività di polimerasi.In cuntrastu à a Taq DNA polimerasi modificata chimicamente per l'iniziu termale, l'enzima Platinum ùn hà micca bisognu di un insulamentu prolongatu à 94 ℃ (10 à 15 minuti) per attivà a polimerasi.Cù PlatinumTaq DNA polimerasi, u 90% di l'attività di Taq DNA polimerasi hè stata restaurata dopu à 2 minuti à 94 ℃.

Foreasy HS Taq DNA Polymerase

11. Nest-PCR

I round successivi di amplificazione cù primers nidificati ponu migliurà a specificità è a sensibilità.A prima volta hè una amplificazione standard di 15 à 20 cicli.Una piccula frazzioni di u pruduttu di amplificazione iniziale hè stata diluita da 100 à 1000 volte è aghjunta à a seconda volta di amplificazione per 15 à 20 cicli.In alternativa, u pruduttu amplificatu iniziale pò esse dimensionatu da purificazione di gel.Un primer nidificatu hè utilizatu in a seconda volta di amplificazione, chì pò ligà à a sequenza di destinazione in u primu primer.L'usu di PCR nidificatu riduce a pussibilità di l'amplificazione di parechji siti di destinazione perchè ci sò pochi sequenze di destinazione cumplementarii à i dui gruppi di primers.U listessu numeru tutale di ciculi (30 à 40) cù i stessi primers amplificò i siti non specifichi.A PCR nidificata aumenta a sensibilità di sequenze target limitate (per esempiu, mrnas rari) è migliurà a specificità di PCRS difficili (per esempiu 5' RACE).

12. PCR discendente

A PCR discendente migliora a specificità utilizendu cundizioni di annealing strette per i primi ciculi di PCR.U ciculu principia à una temperatura di ricottura circa 5 ℃ più altu di a Tm stimata, dopu ogni ciculu hè ridutta da 1 ℃ à 2 ℃ finu à chì a temperatura di recuit hè sottu à Tm 5 ℃.Solu u mudellu di destinazione cù a più alta omologia serà amplificatu.Questi prudutti cuntinueghjanu à espansione in i ciculi successivi, escludendu i prudutti amplificati non specifichi.A PCR discendente hè utile per i metudi induve u gradu di l'omologia trà u primer è u mudellu di destinazione ùn hè micca cunnisciutu, cum'è l'impronta di DNA AFLP.

Kit PCR correlati

 PCR Easyᵀᴹ (Cù Tintura)

L'eroe 2 × PCR^TMU sistema Mix hà una tolleranza più alta à l'inibitori di PCR cà u sistema PCR Mix ordinariu, è pò facilmente affruntà l'amplificazione PCR di vari mudelli cumplessi.U sistema di reazione unicu è Taq Hero d'alta efficienza facenu chì a reazione PCR hà una efficienza di amplificazione, specificità è sensibilità più altu.

 PCR Heroᵀᴹ (Cù Tintura)

Efficienza di amplificazione più alta

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Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

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RT-PCR Easyᵀᴹ I (Un Passu)

U kit usa un reattivu di trascrizione inversa Foregene unicu è Foregene HotStar Taq DNA Polymerase cumminatu cù un sistema di reazione unicu per migliurà efficacemente l'efficienza di amplificazione è a specificità di a reazione.