I transcriptasi tradiziunali inversi ùn ponu micca tollerà temperature elevate (a temperatura ottima per l'attività MMLV hè 37-50 ° C, è AMV hè 42-60 ° C).L'RNA virali più cumplessu ùn pò micca esse trascrittu in modu inversu in cDNA à basse temperature, risultatu in efficienza di rilevazione A riduzzione.RT-qPCR tradiziunale generalmente richiede a participazione di dui enzimi chjave (transcriptase inversa è DNA polimerasi), chì rende impussibile simplificà l'operazione di u sistema di reazzione è riduce u costu.Quì avemu da presentà dui transcriptasi inversi resistenti à alta temperatura, TtH è RevTaq.Sti dui enzimi anu ancu a funzione di DNA polimerasi, cusì sò chjamati enzimi bifunzionali.

TtH DNA polimerasi

Duvete avè intesu parlà di TtH, chì hè derivatu da a bacteria termofila Thermus thermophilus HB8.In presenza di cationi divalenti cum'è Mg2+, hà attività di DNA polimerasi.Hè largamente utilizatu in reazzioni di PCR cum'è l'enzima Taq, ma hà una resistenza à u calore più altu ch'è l'enzima Taq, cusì hà ancu un effettu megliu nantu à a PCR cù mudelli di cuntenutu altu di GC.

· Questa enzima ùn hà micca l'attività exonuclease 3′→5′ è l'attività exonuclease 5′→3′, cusì pò ancu esse usata per a sequenza di didesossi.

· Questa enzima hà attività RTase.In presenza di Mn2+, l'attività di RTase serà rinfurzata.Utilizendu sta funzione, pò esse aduprata per realizà a reazione di trascrizione inversa è a reazione PCR in u stessu tubu, vale à dì, RT-PCR in un passu.Tuttavia, in presenza di Mn2 +, a precisione di RT-PCR ùn hè micca alta.L'attività RT ùn hà nunda di fà cù l'attività rnaase H.

· L'attività aumentata di Tth-DNA polymerase (pH9, ottima + 55 ℃ ~ + 70 ℃, massimu + 95 ℃) supera i prublemi causati da a struttura secundaria di RNA.U cDNA risultatu pò esse amplificatu da PCR cù a listessa enzima in presenza di ioni Mg2 +.

· L'abilità di a polimerasi Tth-DNA per realizà a trascrizione inversa è l'amplificazione di l'ADN à alte temperature rende questa enzima utile per a RT-PCR quantitativa, a clonazione è l'analisi di l'espressione genica di RNA cellulare è virali.
· Tth-DNA polimerasi hè aduprata per a RT-PCR per amplificà l'RNA finu à 1kb.

Caratteristiche è vantaghji

Tth DNA polimerasi:

• Assicurà a dimensione di u produttu di a reazione di a catena di polimerasi (PCR) ottimizzata, almenu 1000 bp in a reazione RT-PCR

• Accettate desoxyribonucleoside trifosfatatu mudificatu cum'è sustrato

• Ùn hè micca in relazione cù l'attività RNase H

• Hà una alta stabilità termale per superà i prublemi, generalmente ligati à l'alta struttura secundaria presente in RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimerasi

Una DNA polimerasi resistente à u calore cù attività di transcriptase inversa

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerasi hè una enzima ingegneria, altamente resistente à u calore, doppiu-funzionale cù attività di transcriptase inversa è DNA polimerasi ottenute per evoluzione diretta è artificiale.

· L'emivita di RevTaq RT-PCR DNA polimerasi à 95 ° C hè più grande di 40 minuti.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasi permette a trascrizzione inversa à alta temperatura direttamente da u mudellu RNA, è u passu di trascrizzione inversa pò esse ripetuta parechje volte per generà più mudelli di cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasi permette una RT-PCR "zero-step" (senza un passu di trascrizione inversa isotermica), perchè in u passu di estensione ciclica di PCR, a trascrizzione inversa è l'amplificazione di DNA si verificanu simultaneamente.Questu prumove ancu a reazione di trascrizzione inversa à alte temperature, minimizendu cusì i prublemi scontri in a fusione di a struttura secundaria forte in l'RNA à alte temperature.

· A causa di a formula di partenza calda basata in aptamer, RevTaq RT-PCR DNA polymerase pruducerà risultati megliu quandu a temperatura di annealing è di estensione hè più altu di 57 ° C.

· Siccomu l'enzima hè resistente à u calore, hè cunsigliatu di disignà primers è sonde cù punti di fusione assai alti (> 60 ° C).

· Hè ricumandemu per ottimisà a temperatura di u passu di annealing/estensione attraversu un gradiente di temperatura durante u prucessu di setup di reazione.

· A più alta a temperatura, più a specificità di a PCR.U ciculu di trascrizione inversa hè generalmente realizatu à una temperatura più altu ch'è u ciculu PCR, perchè l'ibridazione di DNA Primer:RNA Template generalmente hà un puntu di fusione più altu ch'è DNA Primer:cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasi hè geneticamente ingegneria è ottimizzata, è a dimensione di l'amplicon hè trà 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polimerasi limite di rilevazione raggiunge 4 copie/

U sistema di reazzione ottimisatu (u stabilimentu di primers di altu puntu di fusione) hè mostratu in a figura.RevTaq RT-PCR DNA polimerasi-driven RT-PCR mostra una sensibilità megliu cà TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, è un gradiente di diluzione di campionu di rilevazione più basso.

Più vantaghji:

Funzione di partenza rapida → U passu iniziale di denaturazione termale pò esse saltatu.

Formula aptamer hot-start → Furnisce immediatamente 100% di attività enzimatica è impedisce l'amplificazione non specifica à basse temperature (<57 ° C).

Funzione di scissione → U passu di estrazione di RNA hè omessa, perchè RevTaq RT-PCR DNA polimerasi pò ancu processà campioni di reazione cruda.Puderà immediatamente distrughje a membrana cellulare di eucarioti, batteri è virus in un ciclu RT-PCR caldu.

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