1. Cunniscenza basica (se vulete vede a parte sperimentale, per piacè trasfiriri direttamente à a seconda parte)
Cum'è una reazione derivativa di a PCR convenzionale, a PCR in tempu reale monitora principalmente u cambiamentu di a quantità di pruduttu di amplificazione in ogni ciculu di a reazione di amplificazione di PCR in tempu reale attraversu u cambiamentu di u signale di fluorescenza, è analizza quantitativamente u mudellu di partenza attraversu a relazione trà u valore ct è a curva standard.
I dati specifichi di RT-PCR sòbasale, soglia di fluorescenzaèvalore Ct.
| basale: | U valore di fluoriscenza di u ciculu 3-15 hè a basa (baseline), chì hè causata da l'errore occasionale di a misurazione. |
| Threshold (threshold): | Si riferisce à u limitu di rilevazione di fluoriscenza stabilitu in una pusizione adatta in a regione di crescita esponenziale di a curva di amplificazione, in generale 10 volte a deviazione standard di a basa. |
| valore CT: | Hè u numeru di cicli di PCR quandu u valore di fluoriscenza in ogni tubu di reazione righjunghji u limitu. U valore Ct hè inversamente proporzionale à a quantità di mudellu iniziale. |
Metodi di etichettatura cumuni per RT-PCR:
| metudu | vantaghju | carenza | scopu di applicazione |
| SYBR GreenⅠ | Ampia applicabilità, sensibile, economica è cunvene | I requisiti di prima sò alti, propensi à bande non specifiche | Hè adattatu per l'analisi quantitativa di diversi geni di destinazione, a ricerca nantu à l'espressione genica, è a ricerca nantu à l'animali è e piante ricombinanti transgenici. |
| TaqMan | Bona specificità è alta ripetibilità | U prezzu hè altu è adattatu solu per scopi specifichi. | A rilevazione di patogeni, a ricerca di geni di resistenza à a droga, a valutazione di l'efficacità di a droga, u diagnosticu di e malatie genetiche. |
| faro moleculare | Alta specificità, fluoriscenza, fondu bassu | U prezzu hè altu, hè adattatu solu per un scopu specificu, u disignu hè difficiule, è u prezzu hè altu. | Analisi di geni specifichi, analisi SNP |
2. Passi spirimintali
2.1 À propositu di u gruppu sperimentale- ci deve esse parechje pozzi in u gruppu, è deve esse ripetizioni biologiche.
| ① | U cuntrollu in biancu | Adupratu per detectà u statu di crescita di e cellule in esperimenti |
| ② | SiRNA di cuntrollu negativu (sequenza siRNA non specifica) | Dimostra a specificità di l'azzione RNAi.siRNA pò induce una risposta di stress non specifica à una cuncentrazione di 200 nM. |
| ③ | Controlu di reagenti di trasfezzione | Esclude a toxicità di u reattivu di trasfezzione à e cellule o l'effettu nantu à l'espressione di u genu di destinazione |
| ④ | siRNA contru u genu di destinazione | Abbatti l'espressione di u genu di destinazione |
| ⑤ (opcional) | siRNA pusitivu | Adupratu per risolve u sistema sperimentale è i prublemi operativi |
| ⑥ (opcional) | SiRNA di cuntrollu fluorescente | L'efficienza di a trasfezzione cellulare pò esse osservata cù un microscopiu |
2.2 Principi di cuncepimentu di primer
| Dimensione di fragmentu amplificatu | Preferibilmente à 100-150bp |
| Lunghezza di prima | 18-25 pb |
| cuntenutu GC | 30%-70%, preferibile 45%-55% |
| valore Tm | 58-60 ℃ |
| Sequenza | Evite T / C cuntinuu;A/G continuu |
| 3 sequenza finale | Evite GC rich o AT rich;a basa terminale hè preferibile G o C;hè megliu per evità T |
| Cumplimentarità | Evitate sequenze cumplementarii di più di 3 basi in u primer o trà dui primers |
| Specificità | Aduprà a ricerca di blast per cunfirmà a specificità di prima |
①SiRNA hè specificu per spezie, è e sequenze di e diverse spezie seranu diverse.
②SiRNA hè imballatu in polvere liofilizzata, chì pò esse almacenata in modu stabile per 2-4 settimane à a temperatura di l'ambienti.
2.3 Strumenti o reagenti chì deve esse preparatu in anticipu
| Primer (riferimentu internu) | Cumpresu avanti è retrocede dui |
| Primers (gene di destinazione) | Cumpresu avanti è retrocede dui |
| Target Si RNA (3 strisce) | In generale, a cumpagnia sintetizà 3 strisce, è poi sceglie una di e trè per RT-PCR |
| Kit di trasfezzione | Lipo2000 ecc. |
| Kit di estrazione rapida di RNA | Per l'estrazione di RNA dopu a trasfezzione |
| Kit di trascrizione rapida inversa | per a sintesi di cDNA |
| Kit di amplificazione PCR | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Riguardu à i prublemi chì deve esse attentu à i passi sperimentali specifichi:
①siRNA prucessu di trasfezzione
1. Per u plating, pudete sceglie 24-well plate, 12-well plate o 6-well plate (a cuncentrazione media di RNA pruposta in ogni pozzu di una piastra 24-well hè di circa 100-300 ng / uL), è a densità ottima di trasfezzione di e cellule hè finu à 60% -80% o più.
2. I passi di trasfezzione è esigenze specifiche sò strettamente in cunfurmità cù l'urdinamentu.
3. Dopu a trasfezzione, i campioni ponu esse cullati in l'ora di 24-72 per a rilevazione di mRNA (RT-PCR) o a deteczione di a proteina in 48-96 ore (WB)
② prucessu d'estrazzioni di RNA
1. Impedisce a contaminazione da enzimi esogeni.Include principarmenti purtendu maschere è guanti strettamente;utilizendu punte di pipette sterilizzate è tubi EP;l'acqua utilizata in l'esperimentu deve esse RNase-Free.
2. Hè ricumandemu di fà duie volte cum'è suggeritu in u kit d'estrazione rapida, chì veramente migliurà a purità è u rendiment.
3. U liquidu di scarti ùn deve micca toccu a colonna RNA.
③ quantificazione di RNA
Dopu chì l'RNA hè stata estratta, pò esse quantificata direttamente cù Nanodrop, è a lettura minima pò esse 10ng/ul.
④Processu di trascrizione inversa
1. A causa di l'alta sensibilità di RT-qPCR, almenu 3 pozzi paralleli deve esse fatte per ogni mostra per impediscenu chì u Ct sussegwente sia troppu sfarente o SD per esse troppu grande per l'analisi statistiche.
2. Ùn freeze è thaw Master mix ripetutamente.
3. Ogni tubu / burato deve esse rimpiazzatu cù una nova punta !Ùn aduprate micca in permanenza a stessa punta di pipette per aghjunghje campioni!
4. U filmu attaccatu à u platu di 96 pozzu dopu l'aghjunghje a mostra deve esse lisciatu cù un platu.Hè megliu centrifugà prima di mette nantu à a macchina, perchè u liquidu nantu à u muru di u tubu pò scorri è caccià e bolle d'aria.
⑤ Analisi di a curva cumuna
| Nisun periodu di crescita logaritmica | Possibile alta cuncentrazione di mudellu |
| Nisun valore CT | Passi incorretti per a rilevazione di signali fluorescenti; degradazione di primers o probes - a so integrità pò esse rilevata da l'elettroforesi PAGE; quantità insufficiente di mudellu; degradazione di mudelli - evitendu l'intruduzioni di impurità è a congelazione ripetuta è u scongelu in a preparazione di mostra; |
| Ct> 38 | efficienza di amplificazione bassa;U pruduttu PCR hè troppu longu;diversi cumpunenti di reazzione sò degradati |
| Curva di amplificazione lineare | E sonde ponu esse parzialmente degradate da cicli ripetuti di congelazione-discongelu o esposizione prolongata à a luce |
| A diferenza in i buchi duplicati hè particularmente grande | A suluzione di reazzione ùn hè micca funnu cumpletamente o a suluzione di reazzione ùn hè micca mischiata;u bagnu termale di l'instrumentu PCR hè contaminatu da sustanzi fluorescenti |
2.5 Circa l'analisi di dati
L'analisi di dati di qPCR pò esse divisa in quantificazione relativa è quantificazione assoluta.Per esempiu, e cellule in u gruppu di trattamentu cumparatu cù e cellule in u gruppu di cuntrollu,
Quante volte l'ARNm di u genu X cambia, questu hè a quantificazione relativa;in un certu numaru di cellule, l'ARNm di u genu X
Quante copie ci sò, questu hè a quantificazione assoluta.Di solitu ciò chì avemu usatu più in u laboratoriu hè u metudu quantitative relative.Di solitu,u metudu 2-ΔΔcthè utilizatu più in esperimenti, cusì solu stu metudu serà introduttu in dettagliu quì.
Metudu 2-ΔΔct: U risultatu ottenutu hè a diffarenza in l'espressione di u genu di destinazione in u gruppu sperimentale relative à u gene di destinazione in u gruppu di cuntrollu.Hè necessariu chì l'efficienze di amplificazione di u genu di destinazione è di u genu di riferimentu internu sò vicinu à u 100%, è a deviazione relativa ùn deve esse più di 5%.
U metudu di calculu hè cusì:
Δct gruppu di cuntrollu = valore ct di u genu di destinazione in u gruppu di cuntrollu - valore ct di u genu di riferimentu internu in u gruppu di cuntrollu
Δct gruppu sperimentale = valore ct di u genu di destinazione in u gruppu sperimentale - valore ct di u genu di riferimentu internu in u gruppu sperimentale
ΔΔct=Δct gruppu sperimentale-Δct gruppu di cuntrollu
Infine, calculate u multiplu di diffarenza in u livellu di espressione:
Cambia Fold = 2-ΔΔct (currispondente à a funzione excel hè POWER)
I prudutti cunnessi:
Tempu di post: May-20-2023
