一、Aumenta a sensibilità di u sistema di reazione:

1. Isolate RNA di alta qualità:

A sintesi di cDNA successu vene da RNA di alta qualità.L'ARN d'alta qualità deve esse almenu à longu andà è senza inhibitori di transcriptase inversa cum'è EDTA o SDS.A qualità di l'RNA determina a quantità massima di informazioni di sequenza chì pudete trascrive in cDNA.Un metudu cumuni di purificazione di l'RNA hè un metudu in un passu cù guanidine isothiocyanate / acid phenol.Per prevene a contaminazione da tracce di RNase, RNA isolatu da campioni ricchi di RNase (cum'è pancreas) deve esse guardatu in formaldeide per priservà RNA d'alta qualità, soprattuttu per u almacenamentu longu.L'RNA estratto da u fegato di u ratu hè statu basamente degradatu dopu esse almacenatu in l'acqua per una settimana, mentre chì l'RNA estratto da u spleen di u ratu hè statu stabile dopu esse almacenatu in acqua per 3 anni.Inoltre, i trascrizioni più longu di 4 kb sò più sensibili à a degradazione da trace RNases cà i trascrizioni chjuchi.Per aumentà a stabilità di i campioni di RNA almacenati, l'RNA pò esse dissolutu in formamide deionized è almacenatu à -70 ° C.A formamide utilizata per priservà l'RNA deve esse libera di detriti degradanti di l'ARN.L'RNA da u pancreas pò esse cunservatu in formamide per almenu un annu.Quandu si preparanu à utilizà RNA, pudete aduprà u metudu seguente per precipitate RNA: aghjunghje NaCl à 0.2M è 4 volte u voluminu di etanol, mette à a temperatura di l'ambienti per 3-5 minuti, è centrifuga à 10 000 × g per 5 minuti.

2. Aduprate a transcriptase inversa RNaseH-inattiva (RNaseH-) ：

L'inhibitori di RNase sò spessu aghjuntu à e reazzioni di trascrizione inversa per aumentà a durata è u rendiment di a sintesi di cDNA.L'inhibitori di RNase deve esse aghjuntu durante a reazione di sintesi di a prima fila in presenza di un buffer è un agentu riduzzione (cum'è DTT), perchè u prucessu prima di a sintesi di cDNA denatura l'inhibitore, liberando cusì RNase ligata chì pò degrada l'RNA.L'inhibitori di a proteina RNase impediscenu solu a degradazione di l'RNA da RNase A, B, C, è ùn impediscenu micca a RNase nantu à a pelle, cusì attentu à ùn intruduce RNase da i vostri ditte malgradu l'usu di sti inhibitori.

A transcriptase inversa catalizza a cunversione di RNA in cDNA.Sia M-MLV è AMV anu attività RNaseH endogena in più di a so propria attività di polimerasi.L'attività di RNaseH è l'attività di polimerasi cumpetenu l'una cù l'altru per u filamentu hibridu furmatu trà u mudellu di RNA è u filamentu di l'ADN primer o l'estensione di cDNA, è degradanu u filamentu di RNA in u cumplessu RNA:DNA.U mudellu di RNA degradatu da l'attività RNaseH ùn pò più serve com'è un sustrato efficace per a sintesi di cDNA, chì riduce u rendiment è a durata di a sintesi di cDNA.Dunque, saria benefiziu per eliminà o riduce assai l'attività RNaseH di a transcriptase inversa.。

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase è thermoScript reverse transcriptase, RNaseH-AMV, ponu ottene più quantità è più cDNA full-length cà MMLV è AMV.A sensibilità RT-PCR serà affettata da a quantità di sintesi di cDNA.ThermoScript hè assai più sensibile cà AMV.A dimensione di i prudutti RT-PCR hè limitata da l'abilità di a transcriptase inversa per sintetizà cDNA, soprattuttu quandu clone cDNA più grande.In cunfrontu cù MMLV, SuperScripⅡ hà aumentatu significativamente u rendiment di i prudutti RT-PCR longu.A transcriptase inversa RNaseH hà ancu aumentatu a termostabilità, perchè a reazione pò esse realizata à temperature più altu ch'è u normale 37-42 ° C.In e cundizioni di sintesi suggerite, utilizate primer oligo(dT) è 10 μCi di [α-P]dCTP.U rendiment tutale di u primu brin hè statu calculatu cù u metudu di precipitazione TCA.L'ADNc di lunghezza completa hè statu analizatu utilizendu bande di dimensioni classificate escise è cuntate nantu à un gel d'agarose alkaline.

3. Aumentà a temperatura di incubazione per a trascrizione inversa:

Una temperatura d'incubazione più alta aiuta à apre a struttura secundaria di RNA, aumentendu u rendiment di a reazione.Per a maiò parte di i mudelli di RNA, l'incubazione di l'RNA è di i primers à 65 ° C senza buffer o sali, seguita da un rapidu raffreddamentu nantu à u ghjacciu eliminerà a maiò parte di e strutture secondarie è permette à i primers di ligà.In ogni casu, certi mudelli anu sempre strutture secondarie, ancu dopu a denaturazione di u calore.L'amplificazione di sti mudelli difficiuli pò esse realizatu utilizendu ThermoScript Reverse Transcriptase è mette a reazione di trascrizzione inversa à una temperatura più altu per migliurà l'amplificazione.Temperature d'incubazione più elevate ponu ancu aumentà a specificità, soprattuttu quandu i primers gene-specifici (GSP) sò usati per a sintesi di cDNA (vede u Capitu 3).Si l'on utilise GSP, assurez-vous que la Tm des amorces soit la même que la température d'incubation attendue.Ùn aduprate micca oligo (dT) è primers aleatoriu sopra à 60 ° C.I primers casuali necessitanu incubazione à 25 ° C per 10 minuti prima di cresce à 60 ° C.In più di utilizà una temperatura di trascrizione inversa più alta, a specificità pò ancu esse migliurata trasferendu direttamente u mischju di RNA/primer da a temperatura di denaturazione di 65 ° C à a temperatura d'incubazione di trascrizzione inversa è aghjunghjendu una mistura di reazione 2x pre-riscaldata (sintesi hot-start cDNA).Stu approcciu aiuta à prevene l'accoppiamentu di basa intermolecular chì si trova à a temperatura più bassa.U cambiamentu di temperatura multiplici necessariu per RT-PCR pò esse simplificatu cù un termociclatore.

Tth polimerasi termostabile agisce cum'è DNA polimerasi in presenza di Mg2+ è cum'è RNA polimerasi in presenza di Mn2+.Pò esse tenutu caldu à una temperatura massima di 65 ° C.In ogni casu, a prisenza di Mn2 + durante a PCR riduce a fideltà, chì rende a polimerasi Tth menu adattata per l'amplificazione d'alta precisione, cum'è a clonazione di cDNA.Inoltre, Tth hà una bassa efficienza di trascrizzione inversa, chì reduce a sensibilità, è, postu chì a trascrizione inversa è a PCR ponu esse realizate cù una sola enzima, e reazzioni di cuntrollu senza trascrizzione inversa ùn ponu esse usate per paragunà i prudutti di amplificazione di cDNA cù DNA genomicu contaminante.I prudutti di amplificazione sò stati separati.

4. Additivi chì prumove a trascrizione inversa:

Additivi cumpresi glicerol è DMSO sò aghjuntu à a reazione di sintesi di u primu filu, chì ponu riduce l'stabilità di l'acidu nucleicu à doppia fila è untie a struttura secundaria di RNA.Finu à 20% glicerol o 10% DMSO pò esse aghjuntu senza affettà l'attività SuperScript II o MMLV.AMV pò ancu tollerà finu à u 20% di glicerol senza perdita di attività.Per maximizà a sensibilità di RT-PCR in a reazione di trascrizzione inversa SuperScriptⅡ, 10% di glicerol pò esse aghjuntu è incubatu à 45 ° C.Se 1/10 di u pruduttu di reazzione di trascrizzione inversa hè aghjuntu à a PCR, allora a cuncentrazione di glicerol in a reazione di amplificazione hè di 0,4%, chì ùn hè micca abbastanza per inibisce a PCR.

5. Trattamentu di RNaseH:

U trattamentu di e reazzioni di sintesi di cDNA cù RNaseH prima di a PCR pò aumentà a sensibilità.Per certi mudelli, hè pensatu chì l'RNA in a reazione di sintesi di cDNA impedisce u ligame di i prudutti di amplificazione, in quale casu u trattamentu RNaseH pò aumentà a sensibilità.In generale, u trattamentu RNaseH hè necessariu quandu si amplificanu mudelli di destinazione di cDNA più longu, cum'è a scherosi tuberosa II di bassa copia.Per questu mudellu difficiuli, u trattamentu RNaseH hà rinfurzatu u signale pruduciutu da SuperScript II o cDNA sintetizatu da AMV.Per a maiò parte di e reazioni RT-PCR, u trattamentu RNaseH hè opzionale, perchè u passu di denaturazione PCR à 95 ° C generalmente idrolizza l'RNA in u cumplessu RNA:DNA.

6. Migliuramentu di Small RNA Detection Method：

RT-PCR hè soprattuttu sfida quandu solu picculi quantità di RNA sò dispunibili.U glucogenu aghjuntu cum'è un trasportatore durante l'isolamentu di RNA aiuta à aumentà u rendiment di picculi campioni.U glucogenu senza RNase pò esse aghjuntu à u stessu tempu chì aghjunghje Trizol.U glucogenu hè soluble in acqua è pò esse mantinutu in a fase aquosa cù RNA per aiutà a precipitazione successiva.Per campioni di menu di 50 mg di tissutu o 106 cellule cultivate, a cuncentrazione cunsigliata di glicogenu senza RNasi hè 250 μg/ml.

Aghjunghjendu BSA acetilatu à a reazione di trascrizzione inversa cù SuperScript II pò aumentà a sensibilità, è per picculi quantità di RNA, riducendu a quantità di SuperScript II è aghjunghjendu 40 unità di RNaseOut nuclease inhibitor pò aumentà u livellu di deteczione.Se u glicogenu hè utilizatu in u prucessu di isolamentu di RNA, hè sempre cunsigliatu di aghjunghje BSA o RNase inhibitor quandu si usa SuperScript II per a reazione di trascrizione inversa.

二、Aumenta a specificità RT-PCR

1. Asintesi CND:

A sintesi di cDNA di u primu filu pò esse iniziata cù trè metudi diffirenti, a specificità relativa di quale afecta a quantità è u tipu di cDNA sintetizatu.

U metudu di prima aleatoriu era u menu specificu di i trè metudi.I primers anneal in parechji siti in tutta a trascrizione, generando cDNA brevi, di lunghezza parziale.Stu metudu hè spessu usatu per ottene sequenze finali 5′ è per ottene cDNA da mudelli di RNA cù regioni di struttura secundaria o cù siti di terminazione chì ùn ponu micca esse replicati da a transcriptase inversa.Per ottene u cDNA più longu, u rapportu di primers à RNA in ogni mostra di RNA deve esse determinatu empiricamente.La concentrazione iniziale di primers casuali variava da 50 a 250 ng per 20 μl di reazione.Siccomu l'ADNc sintetizatu da l'RNA tutale cù primers aleatoriu hè principalmente RNA ribosomi, u poli (A) + RNA hè generalmente sceltu cum'è mudellu.

I primers Oligo (dT) sò più specifichi cà i primers random.Si ibrida à a coda poli (A) chì si trova à l'estremità 3' di a maiò parte di l'ARNm eucarioti.Perchè u poli (A) + RNA hè di circa 1% à 2% di l'RNA tutale, a quantità è a cumplessità di cDNA hè assai menu cà cù primers aleatoriu.A causa di a so alta specificità, l'oligo (dT) generalmente ùn necessita micca ottimisazione di u rapportu di RNA à primers è poly (A) + selezzione.Hè cunsigliatu di utilizà 0.5μg oligo (dT) per 20μl sistema di reazione.oligo (dT) 12-18 hè adattatu per a maiò parte di RT-PCR.U Sistema ThermoScript RT-PCR offre oligo (dT) 20 per via di a so megliu stabilità termica per temperature d'incubazione più elevate.

Gene specific primers (GSP) sò i primers più specifichi per u passu di trascrizione inversa.GSP hè un oligonucleotide antisensu chì pò hibridà specificamente à a sequenza di destinazione di RNA, à u cuntrariu di primers aleatoriu o oligo (dT), chì anneal à tutti l'RNA.E stesse regule utilizzate per cuncepisce i primeri PCR s'applicanu à u disignu di GSP in reazioni di trascrizione inversa.U GSP pò esse a listessa sequenza cum'è l'amorce di amplificazione chì anneals à l'estremità 3' più di l'ARNm, o u GSP pò esse cuncepitu per anneal downstream di l'amorce di amplificazione inversa.Per certi sughjetti amplificati, più di un primer antisensu deve esse designatu per una RT-PCR riescita perchè a struttura secundaria di l'RNA di destinazione pò impedisce u ligame di u primer.Hè cunsigliatu di utilizà 1 pmol GSP antisensu in una reazione di sintesi di prima fila di 20 μl.

2. Aumentà a temperatura di incubazione per a trascrizione inversa:

Per prufittà di tuttu u vantaghju di a specificità GSP, deve esse aduprata una transcriptase inversa cù una termostabilità più alta.I transcriptasi inversi termostabili ponu esse incubati à temperature più altu per aumentà a stringenza di a reazione.Per esempiu, se un GSP annulla à 55 ° C, a specificità di u GSP ùn serà micca utilizzatu cumplettamente se AMV o M-MLV hè utilizatu per a trascrizione inversa à una bassa stringenza di 37 ° C.In ogni casu, SuperScript II è ThermoScript ponu esse reagiti à 50 ° C o più, chì eliminà i prudutti micca specifichi generati à temperature più bassu.Per a massima specificità, u mischju di RNA/primer pò esse trasferitu direttamente da a temperatura di denaturazione di 65 ° C à a temperatura di incubazione di a trascrizione inversa è aghjunghje à una mistura di reazione 2 × pre-riscaldata (sintesi di cDNA hot start).Questu aiuta à prevene l'accoppiamentu di basa intermolecular à basse temperature.E transizioni multiple di temperatura necessarie per RT-PCR ponu esse simplificate usendu un termociclatore.

3. Reduce a contaminazione di DNA genomicu:

Una difficultà potenziale incontrata cù RT-PCR hè a contaminazione di DNA genomicu in l'RNA.Utilizà un bonu metudu di isolamentu di RNA, cum'è Trizol Reagent, riducerà a quantità di DNA genomicu chì contamina a preparazione di RNA.Per evitari prudutti derivati ​​​​da DNA genomicu, l'RNA pò esse trattatu cù DNase I di amplificazione per sguassà l'ADN contaminante prima di a trascrizione inversa.A digestione DNase I hè stata terminata incubando i campioni in 2.0 mM EDTA per 10 minuti à 65 ° C.L'EDTA pò chelate l'ioni di magnesiu, prevenendu l'idrolisi di l'RNA dipendente da ioni di magnesiu à alte temperature.

Per separà l'ADNc amplificatu da i prudutti di amplificazione di l'ADN genomicu contaminanti, i primers ponu esse designati chì ogni anneal per separà esoni.I prudutti PCR derivati ​​​​da cDNA seranu più brevi di quelli derivati ​​​​da DNA genomicu contaminatu.Inoltre, un esperimentu di cuntrollu senza trascrizzione inversa hè statu realizatu nantu à ogni mudellu di RNA per determinà se un fragmentu determinatu hè derivatu da DNA genomicu o cDNA.U pruduttu PCR ottenutu senza trascrizzione inversa hè derivatu da u genoma.