Panoramica
Identificazione rapida di e piante transgeniche
Testu / Tong Yucheng
Operazione sperimentale / Han Ying
Editore / Wen Youjun
Parolle / 1600+
Tempu di lettura suggeritu / 8-10 minuti
Identificazione rapida di e piante transgeniche
Cum'è un novu in u laburatoriu, ùn hè micca un bonu travagliu per scacciate i pianti pusitivi da un munzeddu di piante cù una rata di cunversione bassa.Prima, l'ADN deve esse estratto da un gran numaru di campioni unu per unu, è dopu i geni stranieri seranu rilevati da PCR.In ogni casu, i risultati sò spessu spazii è bande cù uni pochi d'articuli in ocasioni, ma hè impussibile di determinà s'ellu ci sò rilevazioni mancate o falsi rilevazioni..Hè assai impotente per affruntà un tali prucessu sperimentale è risultati?Ùn vi ne preoccupate, u fratellu vi insegna à schermu e piante transgeniche pusitivi facilmente è precisamente.
Passu 1: Disegnu primer di rilevazione
Determina u genu endogenu è u genu esogenu per esse rilevatu secondu a mostra per esse testata, è selezziunate una sequenza rappresentativa di 100-500bp in u genu per u disignu di primer.I boni primers ponu assicurà l'accuratezza di i risultati di deteczione è accurtà u tempu di deteczione (vede l'appendice per i primi di deteczione cumunimenti usati).
Nota:
I primi di novu designati anu bisognu di ottimisà e cundizioni di reazione è verificate l'accuratezza, a precisione è u limitu di deteczione di a rilevazione prima di realizà a rilevazione à grande scala.
Passu 2:Sviluppà un protocolu sperimentale
Cuntrollu pusitivu: Aduprate l'ADN purificatu chì cuntene u fragmentu di destinazione cum'è mudellu per stabilisce se u sistema di reazione PCR è e cundizioni sò normali.
Cuntrolu negativu / biancu: Aduprate un mudellu di DNA o ddH2O chì ùn cuntene micca u fragmentu di destinazione cum'è mudellu per detectà s'ellu ci hè una fonte di contaminazione in u sistema PCR.
Controlu di riferenza internu: aduprate a cumminazione primer/sonda di u genu endogenu di a mostra per esse testata per valutà se u mudellu pò esse rilevatu da PCR.
Nota:
Cuntrolli pusitivi, negativi / in biancu è cuntrolli di cuntrollu internu deve esse stabilitu per ogni prova per valutà a validità di i risultati sperimentali.
Passu 3: Preparazione di l'esperimentu
Prima di l'usu, osservate se a suluzione hè mischiata uniformemente.Se si trova a precipitazione, deve esse dissolutu è mischju secondu l'istruzzioni prima di l'usu.A mistura 2×PCR deve esse pipettata è mischjata ripetutamente cù una micropipetta prima di l'usu per evità una distribuzione irregolare di ioni.
Nota:
Pigliate l'istruzzioni è leghjite cù cura, è fate preparazioni prima di l'esperimentu in stretta cunfurmità cù l'istruzzioni.
Passu 4: Preparate u sistema di reazzione PCR
Sicondu u protocolu sperimentale, mischjà i primers, H2O, 2×PCR mix, centrifuga e distribuisce in ogni tubu di reazzione.
Nota:
Per teste à grande scala o à longu andà, hè cunsigliatu di utilizà un sistema di reazione PCR chì cuntene l'enzima UNG, chì pò evità efficacemente a contaminazione di l'aerosol causata da i prudutti PCR.
Passu 5: Aggiungi mudellu di reazione
Utilizendu a tecnulugia di PCR diretta, ùn ci hè micca bisognu di un fastidiosu prucessu di purificazione di l'acidu nucleicu.U mudellu di mostra pò esse preparatu in 10 minuti è aghjuntu à u sistema di reazione PCR currispundente.
Nota:
U metudu Lysis hà un effettu di deteczione megliu, è u pruduttu ottenutu pò esse usatu per parechje riazzioni di rilevazione.
5.1: PCR diretta di foglie
Sicondu a dimensione di a stampa in u manuale, tagliate u tessulu foglia cù un diametru di 2-3mm è mette in u sistema di reazzione PCR.
Nota: Assicuratevi chì i frammenti di foglia sò immersi cumpletamente in a suluzione di reazzione PCR, è ùn aghjunghje micca u tessulu di foglia eccessiva.
5.2: Metudu di lisi di foglie
Tagliate u tessulu foglia cù un diametru di 5-7 mm è mette in un tubu di centrifuga.Se sceglite e foglie mature, per piacè evite di utilizà i tissuti di a vena principale di a foglia.Pipette 50ul Buffer P1 lysate in un tubu di centrifuga per assicurà chì u lysate pò immerse completamente u tessulu foglia, mette in un termociclatore o un bagnu di metallu, è lise à 95 ° C per 5-10 minuti.
Add 50ul Buffer P2 neutralization solution è mischjà bè.U lisatu resultanti pò esse usatu cum'è mudellu è aghjuntu à u sistema di reazione PCR.
Nota: A quantità di mudellu deve esse trà 5-10% di u sistema PCR, è ùn deve micca più di 20% (per esempiu, in un sistema di PCR 20μl, aghjunghje 1-2μl di buffer di lisi, micca più di 4μl).
Passu 6: Reazione PCR
Dopu a centrifugazione di u tubu di reazione PCR, mette in un strumentu PCR per amplificazione.
Nota:
A reazione usa un mudellu micca purificatu per l'amplificazione, cusì u nùmeru di ciculi di amplificazione hè di 5-10 ciculi più cà quandu si usa un mudellu di DNA purificatu.
Passu 7: rilevazione di l'elettroforesi è analisi di u risultatu
M: Scala DNA 100bp
1\4: Metudu DNA purificatu
2\5: Metudu PCR direttu
3\6: cuntrollu in biancu
Controlu di qualità:
I risultati di a prova di i diversi cuntrolli stabiliti in l'esperimentu duveranu risponde à e seguenti cundizioni.Altrimenti, a causa di u prublema deve esse analizata, è a prova deve esse realizatu novu dopu chì u prublema hè eliminatu.
Table 1. I risultati di teste nurmali di diversi gruppi di cuntrollu
* Quandu u plasmide hè utilizatu com'è cuntrollu pusitivu, u risultatu di a prova di u genu endogenu pò esse negativu
Giudiziu di u risultatu:
A. U risultatu di a prova di u genu endogenu di l'esemplariu hè negativu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione PCR ordinariu ùn pò micca esse estratti da a mostra o l'ADN estratti cuntene inhibitori di a reazzione PCR, è l'ADN deve esse estratto di novu.
B. U risultatu di a prova di u genu endogenu di a mostra hè pusitivu, è u risultatu di a prova di u genu esogenu hè negativu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione PCR ordinariu hè estratto da a mostra, è pò esse ghjudicatu chì u genu XXX ùn hè micca rilevatu in a mostra.
C. U risultatu di a prova di u genu endogenu di a mostra hè pusitivu, è u risultatu di a prova di u genu esogenu hè pusitivu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione PCR ordinariu hè stata estratta da a mostra, è l'ADN di mostra cuntene u genu XXX.L'esperimenti di cunferma pò esse realizatu in più.
Passu 8: Design primers di rilevazione
Dopu à l'esperimentu, aduprate una soluzione di ipoclorito di sodiu 2% è una solu suluzione di etanolu à 70% per asciugà l'area sperimentale per prevene a contaminazione ambientale.
Appendice
Table 2. Primi cumunimenti usati per a deteczione generale di PCR di e piante geneticamente modificate
Document de référence :
SN / T 1202-2010, Metudu di rilevazione PCR qualitativa per ingredienti vegetali geneticamente mudificati in l'alimentariu.
Ministeru di Agriculture Announcement 1485-5-2010, Testing di l 'ingredienti di pianti genetically mudificati è i so prudutti-risu M12 è i so derivati.
Tempu di post: 09-09-2021
