Cum'è un novu in u laburatoriu, ùn hè micca un bonu travagliu per scacciate e piante pusitivi da una mansa di piante cù una rata di cunversione bassa.Prima, l'ADN deve esse estratto da un gran numaru di campioni unu per unu, è dopu i geni stranieri seranu rilevati da PCR.In ogni casu, i risultati sò spessu spazii è bande cù uni pochi d'articuli in ocasioni, ma hè impussibile di determinà s'ellu ci sò rilevazioni mancate o falsi rilevazioni..Hè assai impotente per affruntà un tali prucessu sperimentale è risultati?Ùn vi ne preoccupate, u fratellu vi insegna à schermu e piante transgeniche pusitivi facilmente è precisamente.

Passu 1

Disegnu primer di rilevazione

Determina u genu endogenu è u genu esogenu per esse rilevatu secondu a mostra per esse testata, è selezziunate una sequenza rappresentativa di 100-500bp in u genu per u disignu di primer.I boni primers ponu assicurà l'accuratezza di i risultati di deteczione è accurtà u tempu di deteczione (vede l'appendice per i primi di deteczione cumunimenti usati).

Avvisu: I primers di novu designu anu bisognu di ottimisà e cundizioni di reazione è verificà l'accuratezza, a precisione è u limitu di rilevazione di a rilevazione prima di a rilevazione à grande scala.

Passu 2

Disegnu un protocolu sperimentale

Cuntrollu pusitivu: Aduprate l'ADN purificatu chì cuntene u fragmentu di destinazione cum'è mudellu per stabilisce se u sistema di reazione PCR è e cundizioni sò normali.

Cuntrollu negativu / biancu: Aduprate u mudellu di DNA o ddH2O chì ùn cuntene micca u fragmentu di destinazione cum'è mudellu per detectà s'ellu ci hè una fonte di contaminazione in u sistema PCR.

Controlu di riferenza internu: aduprate a cumminazione primer/sonda di u genu endogenu di a mostra per esse testata per valutà se u mudellu pò esse rilevatu da PCR.

Avvisu:

Cuntrolli pusitivi, negativi / in biancu è cuntrolli di cuntrollu internu deve esse stabilitu per ogni prova per valutà a validità di i risultati sperimentali.

Preparazione di l'esperimentu

Prima di l'usu, osservate se a suluzione hè mischiata uniformemente.Se si trova a precipitazione, deve esse dissolutu è mischju secondu l'istruzzioni prima di l'usu.A mistura 2×PCR deve esse pipettata è mischjata ripetutamente cù una micropipetta prima di l'usu per evità una distribuzione irregolare di ioni.

Avvisu:

Pigliate u manuale è leghjite cù cura, è fate preparazioni prima di l'esperimentu in stretta cunfurmità cù i requisiti di u manuale.

Passu 4

Preparate u sistema di reazione PCR

Sicondu u protocolu sperimentale, mischjà i primers, H2O, è 2 × PCR mischjà uniformemente, centrifuga è distribuisce à ogni tubu di reazione.

Avvisu:

Per teste à grande scala o à longu andà, hè cunsigliatu di utilizà un sistema di reazione PCR chì cuntene l'enzima UNG, chì pò evità efficacemente a contaminazione di l'aerosol causata da i prudutti PCR.

Passu 5

Aghjunghjite u mudellu di reazione

Utilizendu a tecnulugia di PCR diretta, ùn ci hè micca bisognu di un fastidiosu prucessu di purificazione di l'acidu nucleicu, u mudellu di mostra pò esse preparatu in 10 minuti, è u sistema di reazione PCR currispondente pò esse aghjuntu.

Avvisu:

U metudu di scissione hà un effettu di rilevazione megliu, è u pruduttu ottenutu pò esse usatu per parechje reazzioni di rilevazione.

5.1: espansione diretta di foglie

Sicondu a dimensione di a stampa in u manuale, tagliate u tessulu foglia cù un diametru di 2-3mm è mette in u sistema di reazzione PCR.

Nota: Assicuratevi chì i frammenti di foglia sò immersi cumpletamente in a suluzione di reazzione PCR, è ùn aghjunghje micca u tessulu di foglia eccessiva.

5.2: Metudu di split Leaf

Tagliate u tessulu foglia cù un diametru di 5-7 mm è mette in un tubu di centrifuga.Se sceglite e foglie mature, per piacè evite di utilizà i tissuti di a vena principale di a foglia.Pipette 50ul Buffer P1 lysate in un tubu di centrifuga per assicurà chì u lysate pò immerse completamente u tessulu foglia, mette in un termociclatore o un bagnu di metallu, è lise à 95 ° C per 5-10 minuti.

Add 50ul Buffer P2 neutralization solution è mischjà bè.U lisatu resultanti pò esse usatu cum'è mudellu è aghjuntu à u sistema di reazione PCR.

Nota: A quantità di mudellu hè trà 5-10% di u sistema PCR, è ùn deve micca più di 20% (per esempiu, in un sistema PCR 20μl, aghjunghje 1-2μl di suluzione di lisi, micca più di 4μl).

Passu 6

Reazione PCR

Dopu a centrifugazione di u tubu di reazione PCR, hè postu in un strumentu PCR per amplificazione.

Avvisu:

A reazione usa un mudellu micca purificatu per l'amplificazione, cusì u nùmeru di ciculi di amplificazione hè di 5-10 ciculi più cà quandu si usa un mudellu di DNA purificatu.

Passu 7

Rilevazione di elettroforesi è analisi di risultati

M: scala di DNA da 100 pb

1\4: Metudu DNA purificatu

2\5: Metudu PCR direttu

3\6: cuntrollu in biancu

QC:

I risultati di a prova di i diversi cuntrolli stabiliti in l'esperimentu duveranu risponde à e seguenti cundizioni.Altrimenti, a causa di u prublema deve esse analizata, è a prova deve esse realizatu novu dopu chì u prublema hè eliminatu.

Table 1. I risultati di teste nurmali di diversi gruppi di cuntrollu

* Quandu u plasmide hè utilizatu com'è cuntrollu pusitivu, u risultatu di a prova di u genu endogenu pò esse negativu

Giudiziu di u risultatu:

A. U risultatu di a prova di u genu endogenu di l'esemplariu hè negativu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione PCR ordinariu ùn pò micca esse estratti da a mostra o l'ADN estratti cuntene inhibitori di a reazzione PCR, è l'ADN deve esse estratto di novu.

B. U risultatu di a prova di u genu endogenu di a mostra hè pusitivu, è u risultatu di a prova di u genu esogenu hè negativu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione di PCR ordinariu hè estratto da a mostra, è pò esse ghjudicatu chì u genu XXX ùn hè micca rilevatu in a mostra.

C. U risultatu di a prova di u genu endogenu di a mostra hè pusitivu, è u risultatu di a prova di u genu esogenu hè pusitivu, chì indica chì l'ADN adattatu per a deteczione PCR ordinariu hè stata estratta da a mostra, è l'ADN di mostra cuntene u genu XXX.L'esperimenti di cunferma pò esse realizatu in più.

Passu 8

Disegnu primer di rilevazione

Dopu à l'esperimentu, aduprate una soluzione di ipoclorito di sodiu 2% è una soluzione di etanolu à 70% per asciugà l'area sperimentale per prevene a contaminazione ambientale.