RT-qPCR hè sviluppatu da a tecnulugia PCR ordinaria.Aggiunge chimichi fluorescenti (coloranti fluorescenti o sonde fluorescenti) à u sistema tradiziunale di reazione PCR, è rileva u prucessu di annealing è estensione PCR in tempu reale secondu i so diversi meccanismi luminiscenti.I cambiamenti di signali fluoriscenti in u mediu sò usati per calculà a quantità di cambiamentu di produttu in ogni ciculu di PCR.Attualmente, i metudi più cumuni sò u metudu di tintura fluorescente è u metudu di sonda.

Metodu di tintura fluorescente:
Certi tinti fluoriscenti, cum'è SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., ùn emettenu micca luce per elli stessi, ma emettenu fluoriscenza dopu à ubligatoriu à u groove minore di dsDNA.Dunque, à u principiu di a reazione PCR, a macchina ùn pò micca detectà u signale fluorescente.Quandu a reazione prucede à l'estensione di annealing (metudu à dui passi) o u stadiu di estensione (metudu à trè passi), i filamenti doppiu sò aperti in questu tempu, è a nova DNA polimerasi Durante a sintesi di filamenti, molécule fluorescenti sò cumminati in u dsDNA minor groove è emettenu fluoriscenza.Siccomu u numeru di cicli di PCR aumenta, più è più coloranti si combinanu cù dsDNA, è u signale fluorescente hè ancu rinfurzatu continuamente.Pigliate SYBR Green Ⅰ per esempiu.
Metudu di sonda:
A sonda Taqman hè a sonda di idrolisi più usata.Ci hè un gruppu fluorescente à l'estremità 5' di a sonda, di solitu FAM.A sonda stessa hè una sequenza cumplementaria di u genu di destinazione.Ci hè un gruppu di quenching fluorescente à l'estremità 3' di u fluoroforu.Sicondu u principiu di u trasferimentu di energia di risonanza di fluorescenza (Förster resonance energy transfer, FRET), quandu u gruppu fluorescente reporter (molecula fluorescente donatore) è u gruppu fluorescente quenching (molecula fluorescente accettatore) Quandu u spettru di eccitazione si sovrappone è a distanza hè assai vicina (7-10nm), l'eccitazione di u donatore induce l'autofluorescenza mentre l'autofluorescenza induce a molecula di fluorescenza. hè debilitatu.Dunque, à l'iniziu di a reazione PCR, quandu a sonda hè libera è intacta in u sistema, u gruppu fluoriscente di u reporter ùn emette micca fluoriscenza.Quandu l'annealing, u primer è a sonda si liganu à u mudellu.Durante a fase di estensione, a polimerasi sintetizza continuamente novi catene.L'ADN polimerasi hà attività di esonucleasi 5'-3'.Quandu ghjunghje à a sonda, l'ADN polimerasi idrolizzarà a sonda da u mudellu, separà u gruppu fluorescente di u reporter da u gruppu fluorescente di quencher, è libera u signale fluorescente.Siccomu ci hè una relazione unu à unu trà a sonda è u mudellu, u metudu di sonda hè superiore à u metudu di tintura in quantu à a precisione è a sensibilità di a prova.

Fig 1 Principiu di qRT-PCR

Disegnu di prima
Principii:

I primi deve esse disignati in a regione cunservata di a serie di l'acidu nucleicu è anu specificità.

Hè megliu aduprà a sequenza di cDNA, è a sequenza di mRNA hè ancu accettata.Se no, scopre u disignu di a regione cds di a sequenza di DNA.
A durata di u prodottu quantitative fluorescente hè 80-150bp, u più longu hè 300bp, a lunghezza di prima hè generalmente trà 17-25 basi, è a diffarenza trà i primers upstream è downstream ùn deve esse troppu grande.

U cuntenutu G + C hè trà 40% è 60%, è 45-55% hè u megliu.
U valore TM hè trà 58-62 gradi.
Pruvate di evitari dimeri di primer è autodimeri, (ùn appare micca più di 4 coppie di basi cumplementarii consecutivi) struttura di hairpin, se inevitabbile, fate ΔG<4.5kJ/mol* Se ùn pudete micca assicurà chì gDNA hè statu sguassatu durante a trascrizione inversa. 3) primers e non
specifichi L'omulugia di a sequenza heterogeneously amplified hè preferibile menu di 70% o hà 8 omologia di basi cumplementarii.
basa di dati:
Ricerca CottonFGD per parole chjave
Disegnu di prima:
Conception de l'amorce IDT-qPCR

Fig2 Pagina di strumentu di cuncepimentu di primu in linea IDT

Visualizzazione di a pagina di risultati Fig3
Disegnu di primers lncRNA:
lncRNA:i stessi passi cum'è mRNA.
miRNA:U principiu di u metudu stem-loop: Siccomu tutti i miRNA sò sequenze brevi di circa 23 nt, a deteczione diretta di PCR ùn pò esse realizata, cusì l'uttellu di sequenza stem-loop hè utilizatu.A sequenza di stem-loop hè un DNA monocatena di circa 50 nt, chì pò furmà una struttura di hairpin da sè stessu.3 'A fine pò esse disignata cum'è una sequenza cumplementaria di u frammentu parziale di miRNA, allora u miRNA di destinazione pò esse cunnessu à a sequenza di loop stem durante a trascrizione inversa, è a lunghezza tutale pò ghjunghje à 70bp, chì hè in linea cù a durata di u pruduttu amplificatu determinata da qPCR.Conception d'amorce miRNA à queue.
Rilevazione specifica di l'amplificazione:
Data di basa di dati in linea: CottonFGD blast per similarità di sequenza
Blast locale: Consultate l'usu di Blast + per fà un blast locale, linux è macos ponu stabilisce direttamente una basa di dati lucale, u sistema win10 pò ancu esse fattu dopu avè installatu ubuntu bash.Crea una basa di dati di l'esplosione lucale è l'esplosione lucale;apre ubuntu bash nantu à win10.
Avvisu: U cuttuni di l'altura è u cuttuni di l'isula di mare sò culturi tetraploidi, cusì u risultatu di l'esplosione serà spessu duie o più partite.In u passatu, utilizendu NAU cds cum'è una basa di dati per eseguisce l'esplosione hè prubabile di truvà dui geni omologhi cù solu uni pochi di differenzi SNP.Di solitu, i dui geni omologu ùn ponu esse siparati da u disignu di u primu, perchè sò trattati cum'è listessi.Se ci hè un indel evidenti, u primer hè di solitu cuncepitu nantu à l'indel, ma questu pò purtà à a struttura secundaria di u primer L'energia libera diventa più altu, purtendu à una diminuzione di l'efficienza di amplificazione, ma questu hè inevitabbile.

Rilevazione di a struttura secundaria di primer:
Passi:open oligo 7 → input template sequence → close sub-window → save → localize primer on template, press ctrl + D to set primer length → analizà diverse strutture secondarie, cume self-dimerization body, heterodimer, hairpin, mismatch, ecc.U risultatu di u primu frontale hè bonu, ùn ci hè micca una struttura di dimer è hairpin evidenti, senza basi cumplementarii cuntinui, è u valore assolutu di l'energia libera hè menu di 4,5, mentre chì a prima volta mostra cuntinuu I basi 6 sò cumplementarii, è l'energia libera hè 8,8;in più, un dimeru più seriu appare à l'estremità 3', è un dimeru di 4 basi consecutivi appare.Ancu l'energia libera ùn hè micca alta, u 3 'dimer Chl pò influenzà seriamente a specificità di amplificazione è l'efficienza di amplificazione.Inoltre, hè necessariu di verificà per hairpins, heterodimers, è mistches.

Fig3 risultati di rilevazione oligo7
Rilevazione di efficienza di amplificazione:
L'efficienza di amplificazione di a reazione di PCR influenza seriamente i risultati di a PCR.Ancu in qRT-PCR, l'efficienza di amplificazione hè particularmente impurtante per i risultati quantitativi.Eliminate altre sustanzi, machini è protokolli in u buffer di reazione.A qualità di i primers hà ancu una grande influenza nantu à l'efficienza di amplificazione di qRT-PCR.Per assicurà l'accuratezza di i risultati, sia a quantificazione di fluoriscenza relativa sia a quantificazione di fluorescenza assoluta anu bisognu di detectà l'efficienza di amplificazione di i primers.Hè ricunnisciutu chì L'efficace efficienza di amplificazione qRT-PCR hè trà 85% è 115%.Ci sò dui metudi:
1. Metudu di curva standard:
a.Mix cDNA
b.Diluzione di gradiente
c.qPCR
d.Equazioni di regressione lineare per calculà l'efficienza di amplificazione
2. LinRegPCR
LinRegPCR hè un prugramma per l'analisi di dati RT-PCR in tempu reale, ancu chjamati dati PCR quantitativi (qPCR) basati nantu à SYBR Green o chimica simile.U prugramma usa dati curretti micca di basa, esegue una correzione di basa nantu à ogni campione Separatamente, determina una finestra di linearità è poi usa l'analisi di regressione lineale per adatta una linea retta attraversu u set di dati PCR.Da a pendenza di sta linea hè calculata l'efficienza PCR di ogni mostra individuale.L'efficienza media di PCR per ampliconu è u valore Ct per mostra sò usati per calculà una concentrazione iniziale per mostra, espressa in unità di fluorescenza arbitraria.L'input è l'output di dati sò attraversu una foglia di calculu Excel.Solu mostra
u mischju hè necessariu, senza gradiente
i passi sò richiesti:(Pigliate Bole CFX96 cum'è un esempiu, micca abbastanza Machine cun ABI chjaru)
esperimentu:hè un esperimentu standard qPCR.
qPCR output di dati:LinRegPCR pò ricunnosce duie forme di schedarii di output: RDML o quantificazione Risultu di amplificazione.In fatti, hè u valore di rilevazione in tempu reale di u numeru di ciculu è u signale di fluoriscenza da a macchina, è l'amplificazione hè ottenuta analizendu u valore di cambiamentu di fluoriscenza di l'efficienza di u segmentu lineale.
Selezzione di dati: In teoria, u valore RDML deve esse utilizable.Hè stimatu chì u prublema di u mo urdinatore hè chì u software ùn pò micca ricunnosce RDML, cusì aghju u valore di output excel cum'è i dati originali.Hè ricumandemu di fà un screening grossu di i dati prima, cum'è u fallimentu di aghjunghje campioni, etc. I punti ponu esse sguassati in i dati di output (di sicuru, ùn pudete micca sguassate, LinRegPCR ignurà questi punti in u stadiu dopu)

Fig5 esportazione di dati qPCR

Fig6 selezzione di campioni candidati

Input di dati:Open qualification amplification results.xls, → apre LinRegPCR → file → leghje da excel → selezziunà i paràmetri cum'è mostra in Figura 7 → OK → cliccate determinà e basi

Fig7 passi di input di dati linRegPCR

Risultatu:Se ùn ci hè micca ripetizione, ùn hè micca necessariu un gruppu.Se ci hè a ripetizione, u gruppu pò esse editatu in u gruppu di mostra, è u nome di u genu hè inseritu in l'identificatore, è dopu u stessu genu serà automaticamente agrupatu.Infine, cliccate nant'à u schedariu, export excel, è vede i risultati.L'efficienza di amplificazione è i risultati R2 di ogni pozzu seranu visualizati.Siconda, si divide in gruppi, l'efficienza di amplificazione media corretta serà visualizata.Assicuratevi chì l'efficienza di amplificazione di ogni primer hè trà 85% è 115%.S'ellu hè troppu grande o troppu chjucu, significa chì l'efficienza di amplificazione di u primer hè poviru.

Fig 8 Risultu è output di dati

Prucessu sperimentale:
Requisiti di qualità RNA:
Purità:1.72.0 indica chì ci pò esse isothiocyanate residuale.L'acidu nucleicu pulitu A260 / A230 deve esse intornu à 2 .Se ci hè una forte absorption à 230 nm, indica chì ci sò cumposti organici cum'è ioni fenati.Inoltre, pò esse rilevatu da l'elettroforesi di gel d'agarose 1.5%.Puntu u marcatu, perchè u ssRNA ùn hà micca denaturazione è u logaritmu di u pesu moleculare ùn hà micca una relazione lineale, è u pesu moleculare ùn pò micca esse spressu currettamente.Concentrazione: in teoriamiccamenu di 100ng / ul, se a cuncentrazione hè troppu bassu, a purezza hè generalmente bassa micca alta

Gel RNA Fig9

Inoltre, se a mostra hè preziosa è a cuncentrazione di RNA hè alta, hè cunsigliatu di aliquotà dopu l'estrazione, è dilute l'RNA à una cuncentrazione finale di 100-300ng / ul per a trascrizione inversa.Inu prucessu di trascrizzione inversa, quandu l'mRNA hè trascrittu, oligo (dt) primers chì ponu specificamente unisce à polyA code sò usati per a trascrizione inversa, mentri lncRNA è circRNA usanu primers random hexamer (Random 6 mer) per a trascrizzione inversa di l'RNA tutale Per miRNA, i primers neck-loop specifici di miRNA sò usati per a trascrizione inversa.Parechje cumpagnie anu avà lanciatu kits di tailing speciali.Per u metudu stem-loop, u metudu di tailing hè più cunvene, high-throughput, è reagent-saving, ma L'effettu di distinguiri miRNAs di a listessa famiglia ùn deve esse cum'è u metudu stem-loop.Ogni kit di trascrizione inversa ha requisiti per la concentrazione di primers specifici di geni (stem-loops).A riferenza interna utilizata per u miRNA hè U6.In u prucessu di l'inversione di u troncu-loop, un tubu di U6 deve esse invertitu per separatamente, è i primeri frontali è posteriori di U6 deve esse aghjuntu direttamente.Sia circRNA è lncRNA ponu aduprà HKG cum'è riferenza interna.Inrilevazione di cDNA,
s'ellu ùn ci hè micca prublema cù RNA, cDNA deve ancu esse bè.In ogni casu, se a perfezione di l'esperimentu hè perseguita, hè megliu aduprà un genu di riferimentu internu (Reference gene, RG) chì pò distingue gDNA da cds.In generale, RG hè un genu di a casa., HKG) cum'è mostra in Figura 10;À quellu tempu, aghju fattu a proteina di almacenamiento di soia, è aghju utilizatu l'actin7 chì cuntene introni cum'è riferenza interna.A dimensione di u frammentu amplificatu di questu primer in gDNA era 452bp, è se cDNA hè stata utilizata com'è mudellu, era 142bp.Allora i risultati di a prova truvaru chì a parte di l'ADNc hè stata cuntaminata da gDNA, è hà ancu dimustratu chì ùn ci era micca prublema cù u risultatu di a trascrizione inversa, è puderia esse usatu cum'è mudellu per PCR.Hè inutilità per eseguisce l'elettroforesi di gel d'agarose direttamente cù cDNA, è hè una banda diffusa, chì ùn hè micca cunvince.

Fig 10 rilevazione di cDNA

A determinazione di e cundizioni qPCRhè generalmente micca prublema secondu u protocolu di u kit, soprattuttu in u passu di u valore tm.Se certi primers ùn sò micca bè cuncepiti durante a cuncepimentu di l'amori, chì risultanu in una grande differenza trà u valore tm è i 60 °C teorichi, hè cunsigliatu chì l'ADNc dopu chì i campioni sò stati mischiati, eseguite una PCR gradiente cù primers, è pruvate d'evità di stabilisce a temperatura senza bande cum'è u valore TM.

Analisi di dati

U metudu di processazione PCR quantitativa di fluorescenza relativa convenzionale hè basamente secondu 2-ΔΔCT.U mudellu di trattamentu di dati.

Prodotti Relativi:

PCR in tempu reale faciule^TM - Taqman

PCR in tempu reale faciule^TM -SYBR VERDE I

RT Easy I (Premix Master per a sintesi di cDNA di u primu filu)

RT Easy II (Premix Master per a sintesi di cDNA di u primu filu per qPCR)