Tutti parlanu di u principiu di l'esperimentu qRT-PCR, u disignu di u primu, l'interpretazione di u risultatu, etc., ma pensu chì duverebbe sparte cun voi l'operazione sperimentale di qRT-PCR.Hè chjucu, ma si tratta di risultati.
Prima di fà qRT-PCR, avemu bisognu di avè una cunniscenza chjara di u nostru propiu RNA è i metudi di operazione.Dopu tuttu, i nostri sforzi sò destinati à ottene risultati, piuttostu cà solu praticà.Allora prima di fà qRT-PCR, avemu bisognu di determinà i seguenti prublemi (alcuni di quali sò solu applicabili à SYBR).
1 Sò sicuru chì u vostru RNA ùn hè micca degradatu?
NanoDrop 2000 pò detect solu a cuncentrazione è a purità di l'RNA, ma ùn pò micca detect l'integrità di l'RNA.
U valore RNA (RNA Intesity Number) pò riflette l'integrità di l'RNA, chì hè rilevatu da u sistema Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Schematic diagram of RIN values for different RNA samples (eucariotes)
Tuttavia, i laboratori generalmente ùn anu micca Agilent 2100 Bioanalyzer.In questu casu, pudemu detectà u gel di formaldehyde, ma u requisitu per a quantità tutale di RNA hè altu, cusì u metudu più veloce hè di utilizà l'elettroforesi di gel ordinariu.Hè necessariu per esse in un ambiente senza nuclease, per quessa, hè necessariu di risciacquare u tank di l'elettroforesi, a buttiglia di sol, u bracket di gel è pettine cù l'acqua DEPC.L'agarose hè ancu senza nucleasi (sempre chì hè novu apertu), è u Loading Buffer deve esse apertu quant'è pussibule, cù 1.2% gel.
Innota chì u gelu deve esse dissolutu cumplettamente, altrimenti pruvucarà bande inhomogeneous, cum'è mostra in a mostra 9 in a figura.Se u voltage hè troppu altu o in esecuzione per troppu longu, generà calore è causarà a degradazione di l'RNA, cusì a tensione è u tempu deve esse cuntrullati raghjone.Inoltre, u gel running pò ancu determinà ancu più s'ellu ci hè residu di DNA in a mostra, è osservà s'ellu ci hè un gran numaru di bande ritenute in u pozzu di dispensazione.
Figura.Rilevazione di l'RNA per elettroforesi in gel
2 Sò sicuru di a cuncentrazione di u vostru cDNA?
L'esperienza di i fratelli maiò in u laboratoriu hè chì u cDNA di u sistema 20 ul ottenutu da ogni inversione hè direttamente diluita 20X, mentre chì e sorelle post-doctorale sò diluite 10X.Di solitu dipende da a situazione.Perchè a qualità di l'RNA mintuatu da ogni persona hè diversa, u livellu di inversione hè ancu diversu, è a tecnulugia di inversione pò esse micca stabile.
Allora ogni volta ch'e aghju u cDNA invertitu, prima diluteraghju circa 3 volte, è dopu aduprà u genu di a casa per fà RT-PCR, u nùmeru di ciculi hè in generale di 25 cicli, per identificà a cuncentrazione specifica, è poi determinà u fattore di diluzione finali.
3 Sò sicuru chì i vostri primers sò faciuli d'utilizà?
Pò passà a curva di fusione di qRT-PCR, ma questu custa sempre soldi.Per i laboratorii senza assai soldi, quand'elli ricevenu assai primers, ponu utilizà RT-PCR ordinariu per vede s'ellu hè una sola banda è identificà a specificità di i primi.Se u laboratoriu ùn hè micca curtu di soldi, a specificità di tutti i primi pò esse identificatu una volta attraversu a curva di fusione.
4 Sò sicuru chì e vostre cundizioni sperimentali sò adattati?
SYBR deve esse prutettu da a luce forte, cusì pruvate à spegne a luce sopra quandu aghjunghjenu u reattivu SYBR, è solu bisognu di usà una luce dim per compie.
Conservate SYBR à 4 ° C.Quandu hè in usu, invertite delicatamente su è giù per mischjà bè per evità di scuma, è ùn vortexà micca vigorosamente.
Alcune sorelle più chjuche piace à disegnà marchi nantu à a tavola PCR per paura di mischjà i campioni, chì hè sbagliatu.Perchè i vostri marcatori sò assai prubabile di influenzà a cullizzioni di signali fluoriscenti, in generale ricumandemu à i juniors per utilizà quaderni sperimentali per aiutà in memoria, cum'è mostra quì sottu.
Figura.qRT-PCR schema di carica di mostra
5 Sò sicuru chì fate bè?
Assicuratevi di portà guanti, guanti, guanti, è dì cose impurtanti trè volte.
Per riduce l'esposizione di SYBR à a luce, mi piace personalmente aghjunghje un mudellu prima, cum'è mostra in a figura sottu.Sicondu l'esperienza, l'aghjunzione di una piccula quantità di mudellu hè prubabile di causà errori di campionamentu.Dunque, per minimizzà l'errore causatu da l'aghjunzione di una piccula quantità di mudellu, di solitu duppià u campione di novu, è duppià a quantità quandu aghjunghjenu a mostra per riduce a quantità di H2O2 aghjuntu.
Figura.Schema schematicu di a carica di qRT-PCR
Allora cunfigurate u sistema qRT-PCR cum'è seguita.
Figura.Diagramma di preparazione di u sistema qRT-PCR
NOTA: U prucessu di cunfigurazione deve esse fattu nantu à u ghjacciu.
Dopu aghjunghje a mostra, incolla a film di stampa trasparente.Pruvate micca di tuccà a superficia di a film di stampa trasparente cù e vostre mani, solu operate da u spaziu in i dui lati di a film.Perchè e impronte digitali ponu ancu influenzà a cullizzioni di signali fluorescenti.Allora aduprate una centrifuga per centrifugà rapidamente per 10 s à bassa velocità per impediscenu chì a mostra si pende nantu à u muru.
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Tempu di Postu: Apr-28-2023
