COVID-19 hè una malatia infizziosa causata da u Sindrome Respiratoriu Acutu Severu Coronavirus Type 2. Quandu una persona hè infettata, i sintomi più cumuni includenu febbre, tosse è mancanza di respirazione.

I campioni usati per a prova ponu esse raccolti da tamponi nasofaringeali o tamponi orofaringei.

Cosa hè a PCR?

U metudu standard di rilevazione di coronavirus hè a reazione in catena di polimerasi, PCR.Questu hè un metudu assai utilizatu in a biologia moleculare.Pò copià rapidamente milioni à miliardi di frammenti di DNA specifichi.

U novu coronavirus cuntene un genomu di RNA unicu filatu assai longu.Per detectà sti virus per PCR, e molécule di RNA devenu esse cunvertite in e so sequenze di DNA cumplementarii da a transcriptase inversa, è dopu l'ADN di sintesi di novu pò esse amplificatu da i prucessi standard di PCR, chì hè comunmente cunnisciutu cum'è RT-PCR.

U prucessu di RT-PCR

estrazione di RNA

Per fà stu metudu, l'RNA virali deve esse estratti.Una varietà di kit di purificazione di RNA pò esse aduprata per una separazione còmuda, rapida è efficace.

Per estrattà l'RNA virali cù un kit cummerciale, prima aghjunghje a mostra à un tubu di microcentrifuga è poi mischjà cù u buffer di lisi.Stu buffer hè altamente denaturatu è generalmente hè custituitu di fenol è guanidine isothiocyanate.Inoltre, l'inhibitori di RNase sò generalmente presenti in u buffer di lisi per assicurà l'isolamentu di l'RNA virali intactu.

Dopu avè aghjustatu u buffer di lisi, vortex u tubu di mischju per pulse è incubate à a temperatura di l'ambienti.U virus hè poi lisatu in cundizioni altamente denaturanti furnite da u buffer di lisi.

Dopu chì a mostra hè lisata, un tubu di centrifuga hè utilizatu per u prucessu di purificazione.A mostra hè caricata in u tubu di centrifuga è dopu centrifugata.

Questa prucedura hè un metudu di estrazione in fase solida in quale a fase stazionaria hè custituita da una matrice di gel di silice.

In cundizioni ottimali di u salinu è u pH, e molécule di RNA si liganu à a membrana di silice.

À u listessu tempu, a proteina è altri contaminanti sò eliminati.

Dopu a centrifugazione, mette u tubu di centrifugazione in un tubu di cullezzione pulita, scaccià u filtratu, è poi aghjunghje buffer di lavatura.

Pone u tubu in a centrifuga di novu per furzà u buffer di lavà à traversu a membrana.Questu eliminerà tutte l'impurità rimanenti da a membrana, lascendu solu l'ARN ligatu à u gel di silice.

Dopu chì a mostra hè lavata, mette u tubu in un tubu di microcentrifuga pulita è aghjunghje u buffer d'eluzione.

Dopu hè centrifugatu per forzà u buffer d'eluzione à traversu a membrana.U buffer di l'eluzione elimina l'RNA virali da a colonna di spin è ottene RNA purificatu senza proteini, inhibitori è altri contaminanti.

PASSU 2

Concentratu mistu

Dopu l'estrazione di l'RNA virali, u prossimu passu hè di preparà a mistura di reazione per l'amplificazione PCR.In questu passu, u cuncentrazione hè utilizatu.Questa soluzione concentrata hè una soluzione concentrata premiscelata composta da una premiscela, trascrittasi inversa, nucleotidi, primer forward, reverse primer, sonda TaqMan è DNA polimerasi.

Infine, per compie sta mistura di reazzione, u mudellu RNA hè aghjuntu.I tubi sò mischiati da u vortexing di impulsu, è dopu a mistura di reazzione hè caricata in a piastra PCR.A piastra PCR di solitu cuntene 96 pozzi è pò analizà parechje campioni à u stessu tempu.

PASSU 3

Amplificazione PCR

Dopu, mette a piastra in a macchina PCR, chì hè essenzialmente un termociclatore.

A RT-PCR in tempu reale hè aduprata per detectà u novu coronavirus 2019 amplificando a sequenza di destinazione in u genu RdrRP, u gene E è u gene N.L'scelta di u genu di destinazione dipende da a sequenza di u primer è di a sonda.

U primu passu di RT-PCR hè a trascrizione inversa.U primu filu di DNA cumplementariu hè sintetizatu, chì hè iniziatu da u primer reverse PCR, chì si unisce à a parte cumplementaria di u genoma di l'ARN virali.Allora a transcriptase inversa aghjunghjenu nucleotidi di DNA à l'estremità 3' di u primer per sintetizà DNA cumplementarii à l'RNA virali.A temperatura è a durata di stu passu dipendenu da i primers, RNA target, è transcriptase inversa utilizati.

In seguitu, un passu iniziale di denaturazione hè appiicatu, chì risultatu in a denaturazione di l'ibridu RNA-DNA.Stu passu hè necessariu per attivà l'ADN polimerasi.À u listessu tempu, a transcriptase inversa hè inattivata.

A PCR hè custituita da una seria di cicli termichi.Ogni ciculu si compone di passi di denaturazione, annealing è estensione.

U passu di denaturazione implica u riscaldamentu di a camera di reazione à 95 gradi Celsius è l'utilizanu per a denaturazione di u mudellu di DNA à doppia catena.

In u passu prossimu, a temperatura di a reazione hè ridutta à 58 gradi Celsius, chì permette à l'amorce di avanti per anneal à a parte cumplementaria di u so mudellu di DNA monofilamentu.A temperatura di annealing dipende direttamente da a durata è a cumpusizioni di u primer.

In u passu di estensione, l'ADN polimerasi sintetizza un novu filu di DNA chì hè cumplementariu à u filu di mudellu di DNA.Aghjunghjendu nuclei liberi cumplementarii à u mudellu in a direzzione 5′à 3′ da a mistura di reazione.A temperatura di stu passu dipende da l'ADN polimerasi utilizatu.

Dopu à u primu ciculu, hè ottenutu un target di DNA à doppia fila.

Allora, entre in u sicondu ciclu.L'ADN a doppia fila hè denaturatu per pruduce duie molécule di DNA monocatena.

In u passu prossimu, a temperatura di reazione hè abbassata, i primers sò annealed à ogni mudellu di DNA monofila, è a sonda Taq-man hè annealed à a parte cumplementaria di l'ADN di destinazione.

A sonda TaqMan hè custituita da un fluoroforu ligatu covalente à l'estremità 5' di a sonda oligonucleotide.Quandu eccitatu da a fonte di luce di u ciclor, u fluoroforu emette fluorescenza.Inoltre, a sonda hè cumposta da un quencher à a fine 3.A vicinanza di u gene reporter à u quencher impedisce a deteczione di fluorescenza.

In u passu di estensione, l'ADN polimerasi sintetizza un novu filu.Quandu a polimerasi righjunghji a sonda TaqMan, a so attività endogena di 5'nuclease scinde a sonda, sepandu u tintu da u quencher.

Cù ogni ciculu di PCR, più molécule di tintura sò liberate, risultatu in un aumentu di l'intensità di fluorescenza proporzionale à u numeru di amplicons sintetizzati.

Stu metudu permette di stimà u numeru di una sequenza data presente in a mostra.U numaru di frammenti di DNA a doppia fila raddoppia in ogni ciculu.Per quessa, a PCR pò esse usata per analizà campioni assai chjuchi.

Per a misurazione di u signale fluorescente, lampada alogena di tungstenu, filtru di eccitazione, riflettore, lente, filtru di emissione è camera CCD cù un dispositivu accoppiatu cù carica.

STEP 4 Detect

Per a misurazione di u signale fluorescente, lampada alogena di tungstenu, filtru di eccitazione, riflettore, lente, filtru di emissione è camera CCD cù un dispositivu accoppiatu cù carica.

A lumera filtrata da a lampa hè riflessa da u riflettore, passa per a lente di condensatore, è hè focu annantu à u centru di ogni burato.Allora a fluoriscenza emessa da u pirtusu hè riflessa da u specchiu, passa per u filtru di emissione, è hè rilevata da a camera CCD.In ogni ciculu di PCR, a luce fluorofora autoexcitata pò esse rilevata da u CCD.

Cunverte a luce catturata in dati digitale.Stu metudu hè chjamatu PCR in tempu reale, è permette un monitoraghju in tempu reale di u prugressu di a reazione PCR.