A PCR (reazione in catena di polimerasi) hè una di e tecnulugia di amplificazione di DNA in vitro, cù una storia di più di 30 anni.

A tecnulugia PCR hè stata pioniera da Kary Mullis di Cetus, USA in 1983. Mullis hà dumandatu una patente di PCR in 1985 è pubblicò u primu documentu accademicu PCR in Science in u stessu annu.Mullis hè statu premiatu u Premiu Nobel in chimica in u 1993 per u so travagliu.

Principi basi di PCR

A PCR pò amplificà i frammenti di DNA di destinazione più di un milione di volte.U principiu hè sottu à a catalisi di l'ADN polimerasi, utilizendu l'ADN di filamentu parentale cum'è un mudellu è un primer specificu cum'è u puntu di partenza per l'estensione.Hè riplicatu in vitro attraversu passi cum'è a denaturazione, l'annealing è l'estensione.U prucessu di l'ADN di filamentu figliu cumplementarii à l'ADN mudellu di filamentu parent.

U prucessu standard di PCR hè divisu in trè fasi:

1.Denaturation: Aduprà alta temperatura per separà DNA doppia filamenti.U ligame di l'idrogenu trà i doppi filamenti di DNA hè rottu à alta temperatura (93-98 ℃).

2.Annealing: Dopu chì l'ADN duppiu-stranded hè siparatu, abbassate a temperatura per chì u primer pò ligà à l'ADN single-stranded.

3.Extension: L'ADN polimerasi cumencia à sintetizà i filamenti cumplementarii longu i filamenti di DNA da i primeri ligati quandu a temperatura hè abbassata.Quandu l'estensione hè cumpleta, un ciculu hè cumpletu, è u nùmeru di frammenti di DNA duppiu

Reciprocate sti trè passi 25-35 volte, u numeru di frammenti di DNA cresce in modu esponenziale.

L'ingenuità di a PCR hè chì diversi primers ponu esse designati per diversi geni di destinazione, perchè i frammenti di geni di destinazione ponu esse amplificati in pocu tempu.

Finu a ora, a PCR pò esse divisa in trè categurie, à dì PCR ordinariu, PCR quantitativa fluorescente è PCR digitale.

A prima generazione di PCR ordinariu

Aduprate un strumentu d'amplificazione PCR ordinariu per amplificà u genu di destinazione, è dopu aduprate l'elettroforesi di gel d'agarose per detectà u pruduttu, solu l'analisi qualitativa pò esse fatta.

I principali svantaghji di a prima generazione di PCR:

1.Prone à l'amplificazione non specifica è risultati falsi pusitivi.

2.The dittizzioni pigghia un longu tempu è u funziunamentu hè cumbersome.

3.Only teste qualitative pò esse fattu

PCR in tempu reale di seconda generazione

Real-Time PCR, cunnisciutu ancu qPCR, usa sonde fluoriscenti chì ponu indicà u prugressu di u sistema di reazzione, è monitoreghja l'accumulazione di prudutti amplificati attraversu l'accumulazione di signali fluoriscenti, è ghjudicheghja i risultati attraversu a curva di fluoriscenza.Pò esse quantificatu cù l'aiutu di u valore Cq è a curva standard.

Perchè a tecnulugia qPCR hè realizata in un sistema chjusu, a probabilità di contaminazione hè ridutta, è u signale di fluoriscenza pò esse monitoratu per a deteczione quantitativa, per quessa hè u più utilizatu in a pratica clinica è hè diventatu a tecnulugia dominante in PCR.

I sustanzi fluorescenti utilizati in a PCR quantitativa fluorescente in tempu reale ponu esse divisi in: sonda fluorescente TaqMan, balise moleculari è tintura fluorescente.

1) Sonda fluorescente TaqMan:

Durante l'amplificazione PCR, una sonda fluorescente specifica hè aghjuntu mentre aghjunghje un paru di primer.A sonda hè un oligonucleotide, è e duie estremità sò marcate cù un gruppu fluorescente reporter è un gruppu fluorescente quencher.

Quandu a sonda hè intacta, u signale fluoriscente emessu da u gruppu di reporter hè assorbita da u gruppu di quenching;durante l'amplificazione di PCR, l'attività di l'esonucleasi 5′-3′ di l'enzima Taq scinde è degrada a sonda, facendu u gruppu fluorescente reporter è quencher U gruppu fluorescente hè separatu, in modu chì u sistema di monitoraghju di fluorescenza pò riceve u signale di fluorescenza, vale à dì, ogni volta chì un filu di DNA hè amplificatu, una furmazione di fluorescenza hè cumpletamente sincronizzata. u pruduttu PCR.

2) Colorante fluorescente SYBR:

In u sistema di reazione PCR, un eccessu di tintura fluorescente SYBR hè aghjuntu.Dopu chì a tintura fluorescente SYBR ùn hè micca specificamente incorporata in a doppia fila di DNA, emette un signalu fluorescente.A molècula di tintura SYBR chì ùn hè micca incorporata in a catena ùn emetterà alcun signale fluoriscente, assicurendu cusì u signale fluoriscente L'aumentu di i prudutti di PCR hè cumpletamente sincronizatu cù l'aumentu di i prudutti di PCR.SYBR si unisce solu à l'ADN à doppia fila, cusì a curva di fusione pò esse usata per stabilisce se a reazione PCR hè specifica.

3) Faro moleculare:

Hè una sonda di oligonucleotide doppiu-labelled di stem-loop chì forma una struttura di hairpin di circa 8 basi à l'estremità 5 è 3.E sequenze di l'acidu nucleicu à e duie estremità sò cumplementarii accoppiate, facendu chì u gruppu fluorescente è u gruppu di quenching sò stretti.Close, ùn sarà micca produttu fluoriscenza.

Dopu chì u pruduttu PCR hè generatu, durante u prucessu di annealing, a parte media di u faro moleculare hè assuciatu cù una sequenza di DNA specifica, è u genu fluorescente hè siparatu da u gene quencher per pruduce fluorescenza.

I principali svantaghji di a PCR di seconda generazione:

A sensibilità hè sempre mancante, è a rilevazione di specimens bassu copia hè imprecisa.

Ci hè l'influenza di u valore di fondo, è u risultatu hè suscettibile à interferenza.

Quandu ci sò inhibitori di PCR in u sistema di reazione, i risultati di deteczione sò suscettibili à interferenza.

PCR digitale di terza generazione

A PCR digitale (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula u numeru di copia di a sequenza di destinazione attraversu a rilevazione di u puntu finale, è pò realizà una rilevazione quantitativa assoluta precisa senza aduprà cuntrolli interni è curve standard.

A PCR digitale usa a deteczione di u puntu finale è ùn dipende micca di u valore Ct (soglia di ciclu), cusì a reazione di PCR digitale hè menu affettata da l'efficienza di amplificazione, è a tolleranza à l'inibitori di a reazione PCR hè migliurata, cù alta precisione è riproducibilità.

A causa di e caratteristiche di alta sensibilità è alta precisione, ùn hè micca facilmente interferitu da inhibitori di reazzione PCR, è pò ottene una vera quantificazione assoluta senza prudutti standard, chì hè diventatu un hotspot di ricerca è applicazione.

Sicondu e diverse forme di l'unità di reazione, pò esse divisa in trè tippi principali: sistemi microfluidic, chip è droplet.

1) PCR digitale microfluidica, mdPCR:

Basatu nantu à a tecnulugia microfluidica, u mudellu di DNA hè separatu.A tecnulugia microfluidica pò realizà a nano-aghjurnamentu di mostra o a generazione di gocce più chjuche, ma e gocce necessitanu un metudu d'adsorzione speciale è dopu cumminate cù u sistema di reazzione PCR.mdPCR hè stata gradualmente aduttatu da altri metudi rimpiazzà.

2) PCR digitale basata in gocce, ddPCR:

Aduprà a tecnulugia di generazione di gocce d'acqua in oliu per processà a mostra in gocce, è divide u sistema di reazzione chì cuntene molécule d'acidu nucleicu in millaie di gocce nanometriche, ognuna di quali ùn cuntene micca a molecula di destinazione di l'acidu nucleicu per esse rilevata, o Contene una à parechje molécule di destinazione di l'acidu nucleicu da pruvà.

3) PCR digitale basata su chip, cdPCR:

Aduprate a tecnulugia integrata di a via di fluidu per incisione parechji microtubi è microcavità in wafers di siliciu o vetru di quartz, è cuntrullà u flussu di a suluzione attraversu diverse valvole di cuntrollu, è divide u liquidu di mostra in nanometri di a stessa dimensione in i pozzi di reazione per a Reazione PCR digitale per ottene una quantificazione assoluta.

I principali svantaghji di a terza generazione di PCR:

L'equipaggiu è i reagenti sò caru.

I requisiti di qualità di u mudellu sò alti.Se a quantità di mudellu supera a quantità di u microsistema, serà impussibile di quantificà, è s'ellu hè troppu chjucu, a precisione di quantificazione serà ridutta.

Falsi pusitivi ponu ancu esse generati quandu ci hè amplificazione non specifica.