PCR, multiplicità PCR, PCR in situ, PCR inversa, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Scuderemu i cuncetti, i passi è i dettagli di diversi PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, chjamata PCR, hè una tecnulugia biologica moleculare chì hè aduprata per ingrandà frammenti di DNA specifichi.Pò esse cunsideratu cum'è una replicazione speciale di DNA in vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) hè statu scupertu prima di u 1955, è Klenow Fragment of E. Coli, chì hà un valore spirimintali è praticità, hè statu scupertu da u Dr H. Klenow in u principiu di l'anni 1970, ma perchè sta enzima ùn tollerà micca a temperatura, l'alta temperatura pò degenerate, per quessa ùn scuntrà micca a reazione di polimerasi alta temperatura.L'enzimi in usu oghje (chjamatu Taq polymerase), sò stati isolati da Thermus aquaticus, un bacteriu di primavera calda in u 1976. A so caratteristica hè chì resiste à a temperatura alta è hè una enzima ideale, ma hè largamente utilizata dopu à l'anni 1980.U cuncettu uriginale di u prototipu primitivu originale di PCR hè simile à a riparazione di u genu è a copia, chì hè stata pruposta da u duttore KJell Kleppe in u 1971. Hà publicatu a prima copia di u genu simplice è di cortu termini (simile à i primi dui reazzioni di u ciclu di PCR).U PCR sviluppatu oghje hè statu sviluppatu da u duttore Kary B. Mullis in u 1983. U duttore Mullis hà servutu l'imprese PE in quellu annu, cusì PE hà un statutu speciale in l'industria PCR.U duttore Mullis hà publicatu ufficialmente u primu documentu cunnessu cù Saiki è altri in u 1985. Da tandu, l'usu di PCR hè millaie di milla per ghjornu, è a qualità di i documenti cunnessi pò esse dichjaratu chì rende assai altri metudi di ricerca unpalatable.In seguitu, a tecnulugia PCR hè largamente usata in a ricerca scientifica biologica è l'applicazioni cliniche, diventendu a tecnulugia più impurtante di a ricerca di biologia moleculare.Mullis hà ancu vintu u Premiu Nobel in Chimica 1993.

PCRPrincipiu

U principiu di basa di a tecnulugia PCR hè simile à u prucessu di replicazione naturali di l'ADN, è a so specificità dipende da u primer oligonucleotide chì hè cumplementariu à i dui estremità di a sequenza di destinazione.A PCR hè cumposta da degenerazione-annealing-estensione di trè fasi di reazzioni basi: ①Degenerazione di DNA template: Dopu chì u DNA template hè riscaldatu à circa 93 ° C per un certu periodu di tempu, a suluzione di DNA duale per l'ADN a doppia catena formata da l'amplificazione PCR di u DNA template Leaving, fate una sola catena per preparà a prossima reazione per a prima volta.②L'annealing (compositu) di l'ADN mudellu è u primer: Dopu chì l'ADN mudellu hè riscaldatu è degeneratu in una sola catena, a temperatura scende à circa 55 ° C.A sequenza cumplementaria di u primer è u mudellu DNA monocatena.③L'estensione di u primer: u mudellu di DNA - u ligame di u primer hè basatu annantu à l'azzione di a polimerasi TaqDNA, cù dNTP cum'è a materia prima di reazione.Mantene u principiu di a replicazione, sintetizà una nova catena di copia semi-riservata chì cumplementa a catena di DNA di mudellu, è ripetite u ciclu di degenerazione-annealing-extension trè prucessi ponu ottene più "catena di copia semi-riservata", è sta nova catena hè dispunibule di novu Diventà un mudellu per u prossimu ciclu.Ci vole 2-4min per compie u ciclu, u genu di destinazione pò esse amplificatu parechji milioni di volte in 2-3 ore.

StandardPCRSistema di reazione

Cinque elementi di a reazione PCR

Ci sò principarmenti cinque tipi di sustanzi implicati in a reazione di PCR, à dì primer, enzima, dNTP, template è buffer (Mg2+ hè necessariu).[Procedura PCR]

U prucessu standard di PCR hè divisu in trè tappe

1. Degenerazione di l'ADN (90 ° C-96 ° C): I mudelli di DNA à doppia catena sottu l'azzione termale, i ligami di l'idrogenu si rompenu, furmendu un DNA di una sola catena.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): A temperatura di u sistema hè ridutta, u primer hè cumminatu cù u mudellu di DNA per furmà una doppia catena lucale.

3. Estensione (70 ℃ -75 ℃): Sutta l'azzione di l'enzyme Taq (circa 72 ° C, u megliu attività), dNTP hè utilizatu com'è materia prima, stende da a fine 5' di u primer → 3' fine, a sintesi è u mudellu cumplementanu ogni altra catena di DNA.

Ogni ciculu hè denaturatu, annealed è allargatu, radduppiendu u cuntenutu di DNA.Attualmente, per via di l'area di amplificazione corta, certi PCR ponu esse riplicati in pocu tempu ancu s'è l'attività di l'enzima Taq ùn hè micca ottimali, cusì pò esse cambiatu à dui passi, vale à dì, l'annealing è l'estensione pò esse realizatu à 60 ° C-65 ° C à u stessu tempu.Per riduce u prucessu di elevazione è rinfrescante è migliurà a velocità di risposta.

Funzioni di reazione PCR

● High-Specificità

I fatturi decisivi specifichi di a risposta PCR sò: ①A cumminazione specifica di u primer è u DNA template.②U principiu di l'accoppiamentu di basa.③A lealtà di a reazione di sintesi di polimerasi TaqDNA.④A specificità è a cunsirvativa di u genu di destinazione.

A cumminazzioni curretta di primers è mudelli hè a chjave.U ligame di u primu è u mudellu è l'estensione di a catena di prima sò basati nantu à u principiu di a basa alkaline matching.A lealtà di e reazzioni di sintesi di polimerasi è a resistenza d'alta temperatura di l'ADN polimerasi Taq per fà u ligame (cumpostu) di u mudellu è di prima in a reazione pò esse realizatu à una temperatura più altu.A specificità di a cumminazzioni hè assai aumentata.U clip pò mantene un altu gradu di curretta.Selezziunate una regione genetica di destinazione cun alta conservativeness è alta conservativeness, a so specificità hè più altu.

● Alta Sensibilità

U voluminu di produzzione di i prudutti PCR hè aumentatu da l'indice, chì pò espansione u mudellu di partenza di Picker (PG = 10-12) per aumentà u livellu di microcontroller à u livellu di microgrammi (μg = -6).Una cellula di destinazione pò esse rilevata da 1 milione di cellule;in a deteczione di virus, a sensibilità di a PCR pò ghjunghje à 3 RFU (spots vacanti formate unità);a tarifa minima di rilevazione in a scienza bacteriana hè di 3 batteri.

● Simple è Fast

A riflessione PCR usa una alta temperatura Taq DNA polymerase, chì aghjunghje a suluzione di reazzione à un tempu, questu hè una reazione di degenerazione-anneal-estensione nantu à a suluzione di amplificazione di DNA è a pignatta di bagnu d'acqua.In generale, a reazione di amplificazione hè cumpleta in 2 à 4 ore.I prudutti aumentati sò generalmente analizati da a spada elettrica, è ùn anu micca aduprà isotopi, senza contaminazione radiuattiva, è prumuzione faciule.

● A purità di u specimenu hè bassu

Ùn ci hè bisognu di separà virus o bacteria è e cellule di cultura.I prudutti di DNA crudi è RNA ponu esse usatu cum'è amplificatori.A rilevazione di l'amplificazione di l'ADN pò esse aduprata direttamente utilizendu esemplari clinichi cum'è sangue, liquidu di u corpu, liquidu di lavatu di tosse, capelli, cellule è tissuti viventi.

PCRprublemi cumuni

● Falsu negativu, senza bande amplificate

I tappe chjave di a reazione PCR includenu: ① preparazione di l'acidi nucleici template, ② qualità è specificità di primers, ③ a qualità di l'enzimi ④ e cundizioni di u ciclu PCR.Truvà u mutivu deve ancu esse analizatu è studiatu per i ligami sopra.

Templates: ① U mudellu cuntene diverse proteine ​​​​, ② U mudellu cuntene un inhibitore di l'enzima Taq, ③ A proteina in u mudellu ùn hè micca eliminata, in particulare a proteina di gruppu in u cromusomu.⑤ A degenerazione di l'acidu nucleicu Deminer ùn hè micca cumpletu.Quandu a qualità di l'enzimi è i primi sò boni, ùn ci hè micca una banda di amplificazione, chì hè più prubabile di trattamentu digestivu di specimens.Ci hè qualcosa di sbagliatu cù u prucessu di estrazione di l'acidu nucleicu di mudellu, cusì per preparà una suluzione di digestioni efficace è stabile, a so prucedura deve esse fissata è micca cambiata arbitrariamente.

Inattivazione di l'enzima: una nova enzima o dui vechji è novi enzimi deve esse usatu inseme per analizà se l'attività enzimatica hè persa o insufficiente, purtendu à falsi negativi.Hè da nutà chì l'enzima Taq o bromuru di ethidium hè qualchì volta scurdatu.

Primer: a qualità di u primu, a cuncentrazione di u primu, è se a cuncentrazione di i dui primers hè simmetrica.Hè un mutivu cumuni per u fallimentu di a PCR o a banda crescente ùn hè micca ideale è propensu à diffusa.Ci sò prublemi cù a qualità di i primi di certi numeri di batch.I dui primers anu una cuncentrazione alta è una cuncentrazione bassa, chì causanu amplificazione asimmetrica di bassa efficienza.I contramisuri sò: ① Selezziunate un bon primer per sintetizà unità.② A cuncentrazione di u primer ùn dipende micca solu da u valore OD, ma presta ancu attenzione à u liquidu originale di u primer per fà l'elettroforesi di gel di zuccheru à agar.Ci deve esse una zona di striscia di primer, è a luminosità di i dui primers deve esse in generale coherente.Cintura, a PCR pò falla à questu tempu, è deve esse risolta cù l'unità di sintesi di prima.Se un primer hè altu, a luminosità hè bassu, è a so cuncentrazione deve esse equilibrata quandu diluted.③ U primer deve esse pagatu è almacenatu à una alta cuncentrazione per prevene parechje congelazione o parti di refrigerazione à longu andà di u frigorifero, chì pruvucarà a prima di deteriorazione è degradazione.④ U disignu di u primer hè irragionevule, cum'è a durata di u primer hè insufficiente, è u di cluster hè furmatu trà i primers.

Mg2 + cuncentrazione: Mg2 + cuncentrazione di ioni hà un grande impattu nantu à l'efficienza di amplificazione PCR.A cuncentrazione eccessiva pò riduce u sessu oppostu di l'amplificazione PCR.Se a cuncentrazione hè troppu bassu, l'output di amplificazione PCR farà ancu u fallimentu di l'amplificazione PCR senza a banda di espansione.

Cambiamentu di u voluminu di reazione: U voluminu utilizatu in l'amplificazione PCR hè 20ul, 30ul, è 50ul o 100ul, u grande volume di l'applicazione per l'amplificazione PCR hè stabilitu secondu diversi scopi di ricerca scientifica è teste cliniche.Dopu avè fattu picculi volumi cum'è 20ul, hè necessariu di fà una cundizione di cordone quandu facia a dimensione, altri ùn falla.

Motivi fisichi: A trasfurmazioni hè assai impurtante per l'amplificazione PCR.Se a temperatura di degenerazione hè bassa, u tempu di degenerazione hè cortu, hè prubabile di accade in falsi negativi;troppu bassu temperatura annealing pò causari amplification non-specific è riduce l'efficienza di amplification specifichi.Affetta assai a cumminazzioni di primers è mudelli per riduce l'efficienza di amplificazione PCR.A volte hè necessariu di utilizà termometri standard per detectà a variabilità, l'annealing è a temperatura allargata in l'estensione o cooker soluble in acqua, chì hè unu di i mutivi di u fallimentu di a PCR.

Varianti di sequenza di destinazione: Se a sequenza di destinazione si trova, una mutazione o eliminazione, a cumminazione di u prototipu è u mudellu hè cumminata, o per a mancanza di una sequenza di destinazione, u primer è u mudellu perderanu a sequenza cumplementaria, è a so amplificazione PCR ùn serà micca successu.

● Falsu pusitivu

A banda di amplificazione di a PCR appare coherente cù a banda di sequenza di destinazione, è qualchì volta a so banda hè più pulita è più alta.

U disignu di u primu ùn hè micca appropritatu: a sequenza di amplificazione scelta è a sequenza di amplificazione non-purpose anu omologu, cusì quandu l'amplificazione di PCR, i prudutti PCR amplificati sò sequenze non-purposeful.A sequenza di destinazione hè troppu corta o u primer hè troppu cortu, è hè propensu à falsi pusitivi.Hè bisognu à esse riprogettatu.

Cross pollution of target sequence or amplification products: Ci hè dui motivi per questa contaminazione: Prima, cross-pollution di u genoma sanu o di grandi segmenti, chì portanu à falsi pusitivi.Stu tipu di falsi pusitivi pò esse risolti da i seguenti metudi: Attenti è gentile durante l'operazione per impediscenu a sequenza di destinazione inalata in a pistola di mostra o splash fora di u tubu centrifugu.Eccettu per l'enzimi è i sustanzi chì ùn ponu micca resistenti à e alte temperature, tutti i reagenti o l'equipaggiu deve esse disinfettati cù alta pressione.I tubi centrifughi è i campioni deve esse usatu in un tempu.Quandu hè necessariu, prima di aghjunghje specimens, u tubu di reazione è u reagentu sò esposti à i raghji ultraviolet per distrughje l'acidu nucleicu esistenti.Siconda, picculi frammenti in a contaminazione di l'aria.Questi picculi frammenti sò più brevi di a sequenza di destinazione, ma anu una certa omologia.Pò esse spliced ​​cù l'altri.Dopu avè cumplementatu i primi, u pruduttu PCR pò esse allargatu, chì pruvucarà a produzzione falsa positiva.Pò esse usatu per riduce o eliminà u metudu PCR di u nidu.

● Apparisce banda amplification nonspecific

I bandi chì apparsu dopu l'amplificazione PCR sò inconsistenti cù a dimensione prevista, o grande o chjuca, o à u stessu tempu, o à u stessu tempu, bandi di amplificazione specifichi è bandi di amplificazione non specifichi.L'emergenza di bandi non specifichi hè: Prima, i primers sò incomplete cumplementarii à a sequenza di destinazione, o a polimerizazione di u primer per furmà un di cluster.U sicondu hè chì a cuncentrazione di MG2 + ioni hè troppu altu, a temperatura di annealing hè troppu bassu, è u nùmeru di cicli di PCR hè in relazione.Siconda, a qualità è a quantità di enzimi.Spessu, l'enzimi di certi fonti sò propensi à bandi non speciali è l'enzimi di l'altra fonte ùn sò micca accaduti.A volte si verificanu ancu amplificazione non specifica di l'enzimi.I contramisuri sò: attrattivi riprogettati se ne necessariu.Reduce a quantità di l'enzima o rimpiazzà l'enzima di una altra fonte.Reduce a quantità di primaria, cresce a quantità di mudelli in modu adattatu, è riduce u numeru di ciculi.Incrementa currettamente a temperatura di annealing o aduprate u metudu di dui punti di temperatura (degenerazione di 93 ° C, annealing è allungamentu à circa 65 ° C).

● Apparisce un tow flaky o smear tape

L'amplificazione di PCR a volte pare esse applicata o sgusciata o cintura cum'è un tappettu.Per u mutivu, per via di a quantità eccessiva di enzimi o di a mala qualità di l'enzima, a cuncintrazione dNTP hè troppu alta, a cuncentrazione di Mg2 + hè troppu alta, a temperatura di annealing hè troppu bassu, è u numeru di ciculi hè troppu.I contramisuri sò: ①Reduce a quantità di enzimi, o cambià l'enzima di una altra fonte.②Reduce a cuncentrazione di dNTP ③Riduce bè a cuncentrazione di Mg2+.④ Aumentà a quantità di mudelli è riduce u numeru di cicli.

I prudutti cunnessi

PCR Heroᵀᴹ (Cù Tintura)

◮ Fideltà più alta: 6 volte quella di l'enzima Taq ordinariu;

◮ Velocità di amplificazione più veloce

◮ Più adattabilità di mudelli

◮ Efficienza di amplificazione più alta

◮ A tolleranza ambientale hè più forte: pusatu à 37 ° C per una settimana, mantenendu più di 90% attività;

◮ Ha attività di DNA polimerasi 5'→3' e attività di esonucleasi 5'→3', senza attività di esonucleasi 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Cù Tintura)

U sistema di reazione unicu è Taq DNA Polymerase d'alta efficienza facenu chì a reazione PCR hà una efficienza di amplificazione, specificità è sensibilità più alta.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ U kit in un passu rende a trascrizione inversa è qPCR duie reazioni in u stessu tubu, solu bisognu di aghjunghje RNA mudellu, primers PCR specifichi è ddH RNase-Free₂O.

◮ U kit pò analizà quantitativamente rapidamente è efficace l'RNA virali o traccia RNA.

◮ U kit usa un reattivu di trascrizione inversa Foregene unicu è Foregene HotStar Taq DNA Polymerase cumminatu cù un sistema di reazione unicu per migliurà efficacemente l'efficienza di amplificazione è a specificità di a reazione.

◮ U sistema di reazione ottimisatu face chì a reazione hà una sensibilità di rilevazione più alta, una stabilità termica più forte è una tolleranza megliu.

◮ RT-qPCR Facile^TM(One Step) - SYBR Green I kit vene cun tintura di riferimentu internu ROX, chì pò esse usata per eliminà u fondu di u signale è l'errore di signale trà i pozzi, chì hè cunvenutu per i clienti à utilizà in diversi mudelli di strumenti PCR quantitativi.

RT Facile^TMII (Master Premix per sintesi di cDNA di u primu filu perPCR in tempu reale)

-Capacità efficace per sguassà gDNA, chì pò sguassà gDNA in u mudellu in 2 minuti.

-Efficace sistema di trascrizione inversa, ci vole solu 15 minuti per compie a sintesi di u primu filu cDNA.

-Modelli cumplessi: mudelli cù un altu cuntenutu di GC è una struttura secundaria cumplessa pò ancu esse invertitu cù alta efficienza.

-Sistema di trascrizione inversa di alta sensibilità, mudelli pg-level ponu ancu ottene cDNA di alta qualità.

-U sistema di trascrizione inversa hà una alta stabilità termica, a temperatura ottimale di reazione hè 42 ℃, è hà sempre una bona prestazione di trascrizione inversa à 50 ℃.