RT-qPCR hè l'esperimentu basu di a biologia moleculare, è ognunu deve esse familiarizatu cun ellu.Include principalmente trè passi: estrazione di RNA, trascrizione inversa in cDNA, è PCR quantitativa fluorescente in tempu reale.Ùn aiuta micca, chì passa ?Hè prubabile chì ci hè un prublema cùl'esperimentu di trascrizione inversa!Ancu s'ellu pare chì l'esperimentu di trascrizzione inversa hà solu bisognu di aghjunghje RNA, dNTP, primers, ètrascrittasi inversaà u tubu centrifuge è mischjà bè, ma in u prucessu di funziunamentu attuale, ci sò ancu assai ditagli chì deve esse pagatu attenti.Amparamu nantu à questu!

Cumu ghjudicà a qualità di l'RNA?
Per ottene cDNA, a qualità di l'RNA hè critica!A qualità di l'RNA pò esse rilevata principalmente da dui aspetti:
(1) Integrità di l'RNA:L'integrità di l'RNA pò esse verificata da l'elettroforesi di gel d'agarose. Pigliendu eucarioti cum'è un esempiu, l'RNA tutale cumpletu hà trè bandi chjaru, i pesi molecolari da grande à chjuca sò 28S, 18S è 5S, è 28S hè duie volte più brillanti cum'è 18S;s'ellu si pò vede trè bande, ma u tipu di banda hè sfocata o Diffusion significa chì l'RNA hè parzialmente degradatu.À questu tempu, per piacè eseguite immediatamente a reazione di trascrizione inversa è aumentate l'input di mudellu in modu adattatu;Se solu una banda cù un picculu pesu moleculare o nisuna banda pò esse vistu, l'RNA hè statu completamente degradatu è deve esse riestratu.Agilent 2100 indica l'integrità di l'RNA cù u diagramma di piccu è u valore RIN.Se l'acidu nucleicu hè intactu, a linea di basa di l'elettroferogramma hè pianu;se l'acidu nucleicu hè severamente degradatu, a basa hè irregulare è più cimi di degradazione appariscenu;u valore di RIN riflette l'integrità di l'RNA, in a gamma di 0-10, u più grande u valore, u megliu a qualità di l'RNA.Ebbè, u più altu u gradu di cumpletu.
(2) Purezza di l'ARN:U rapportu di OD260/280 pò esse rilevatu da spettrofotometria UV.Se u rapportu di OD260 / 280 hè trà 1,9 è 2,1, a purità hè assai bona.
L'ADN genomicu residuale pò purtà à risultati quantitativi imprecisi
Quandu l'RNA hè estrattu, l'RNA chì avemu da esse mischju cù DNA genomicu (gDNA) chì ùn hè micca stata pulita.Dunque, u cDNA dopu a trascrizzione inversa serà ancu mischju cùgDNA.Durante u downstreamqPCRreazione,cDNAè gDNA pò esse amplificatu simultaneamente, risultatu in un valore CT relativamente chjucu, cusì i risultati ponu esse biased.
Allora chì duvemu fà in questa situazione?Foregenesuggerisce:
(1) Eseguite a pulizia di u genoma nantu à l'RNA invertitu, chì pò esse eliminatu da l'estrazione di colonna durante l'estrazione di RNA;
(2) Tratta l'RNA estratti cù DNaseI , ma finiscinu cù EDTA;
di reagenti di trascrizione inversacù moduli di clarificazione di u genoma;

Cumu sceglie i primers per a trascrizione inversa?
I primers di trascrizzione inversa influenzanu ancu u risultatu di a reazione di trascrizione inversa.Pudete sceglie primers aleatoriu, Oligo dT o primers gene-specifici per a trascrizione inversa secondu e circustanze specifiche di l'esperimentu:
(1) Trascrizioni specifiche: i primers specifichi di geni sò cunsigliati;
(2) Trascrizioni di frammenti longu: I primers Oligo dT/gene-specific sò cunsigliati;
(3) Frammenti interni di trascrizioni di segmentu longu: primers gene-specifici / random primers / random primers + Oligo dT.Se l'esperimentu qPCR dopu hè realizatu, l'Oligo dT ùn pò micca esse usatu solu, perchè l'usu di l'Oligo dT solu pò causà 3' end bias, purtendu à risultati imprecisi di l'esperimentu qPCR;
(4) miRNA: Primers Stem-loop o primers tailing ponu esse usatu.

Quante volte deve esse diluitu u cDNA di u produttu di trascrizione inversa per a quantificazione?
Dopu avè ottenutu u cDNA di u pruduttu di trascrizzione inversa, quante volte u cDNA deve esse diluitu per esperimenti qPCR hè assai impurtante.Se a cuncentrazione di cDNA hè troppu alta o troppu bassa, l'efficienza di amplificazione pò esse affettata.Pò esse misurata a cuncentrazione di cDNA, è cumu si deve esse fattu?
(1) A cuncentrazione di cDNA di u produttu di trascrizzione inversa ùn pò esse misurata, perchè in più di u produttu di cDNA, u pruduttu di trascrizzione inversa cuntene ancu Buffer residuale di trascrizzione inversa, transcriptase inversa, primers, etc., chì interferiscenu cù i risultati di a misurazione di a cuncentrazione è causanu OD260/280, OD260/230 ratio anormali è dunque ùn riflette micca u veru cDNA.À questu tempu, certi amichi diceranu, allora misurà a cuncentrazione dopu a purificazione;quì, Foregene vulete ricurdà chì u cDNA ùn hè micca cunsigliatu per esse purificatu, perchè a durata di u cDNA ottenuta da a reversione hè diversa, è u cDNA curtu serà persu in a purificazione.
(2) Allora chì fà ?Prima di l'esperimentu qPCR, u gradiente di diluzione di l'ADNc pò esse determinatu attraversu u pre-esperimentu.Per esempiu: aduprate a solu suluzione di cDNA, a diluzione di 10 volte è a diluzione di 100 volte cum'è mudelli per esperimenti qPCR, è selezziunate u fattore di diluzione cù un valore CT in u intervalu di 18-28.

Cumu deve esse trascrittu inversamente i miRNA?
miRNA hè una piccula molecula RNA monofila cù una dimensione di circa 22 nt chì ùn codifica micca per a proteina.A causa di a so curta durata, u metudu qPCR cunvinziunali hè difficiule di quantificà direttamente, cusì hè spessu necessariu di allargà miRNA;i metudi di trascrizzione inversa cumunimenti usati per miRNA includenu u metudu di loop di stem è u metudu di coda.
U metudu stem-loop hè di allargà u miRNA aghjunghjendu primers stem-loop.Stu metudu di deteczione hà più sensibilità è specificità, ma u throughput di deteczione hè bassu.Una trascrizzione inversa pò detect solu un miRNA è una riferenza interna;lu mètudu cuda-aghjunghje hè cumpostu di dui Hè cumpleta da l 'azzione cumuna di dui enzimi, chì sò PolyA polymerase è transcriptase inversa.PolyA polymerase hè rispunsevuli di aghjunghje PolyA code à miRNA per aumentà a so lunghezza, è a transcriptase inversa realiza a reazione di trascrizione inversa.Stu metudu hà un altu rendimentu di rilevazione è pò detectà parechji miRNA è riferimenti interni in una sola trascrizione inversa, ma a sensibilità è a specificità sò bassu in u metudu di loop stem.