A PCR hè a tecnulugia di amplificazione di l'acidu nucleicu più usata è hè largamente usata per via di a so sensibilità è specificità.Tuttavia, a PCR richiede una denaturazione termale ripetuta è ùn pò micca sbarazzarsi di e limitazioni di s'appoghjanu à l'instrumenti è l'equipaggiu, chì limita a so applicazione in teste di campu clinicu.

Dapoi u principiu di l'anni 1990, parechji laboratorii anu cuminciatu à sviluppà a tecnulugia di amplificazione di temperatura constante chì ùn hà micca bisognu di denaturazione termale.Avà anu sviluppatu a tecnulugia di amplificazione isotermica mediata da loop, a tecnulugia di amplificazione isotermica di rimpiazzamentu di filamenti, a tecnulugia di amplificazione isotermica di rolling circle, è a dependenza di a sequenza di l'acidu nucleicu.Tecnulugia di amplificazione isotermica è altre tecnulugia. 

Lamplificazione isotermica mediata da oop

U principiu di amplificazione hè basatu annantu à u fattu chì l'ADN hè in un statu di equilibriu dinamicu à circa 65 ° C.Quandu qualsiasi primer hè appigatu di basi è estendu à a parte cumplementaria di l'ADN à doppia catena, l'altru filamentu dissociarà è diventerà monocatenariu.

A questa temperatura, l'ADN usa 4 primers specifichi per s'appoghjanu nantu à una DNA polimerasi di spustamentu di filamentu per fà a sintesi di DNA di spustamentu di filamentu autocirculate continuamente.

Prima determinà e 6 regioni specifiche F3, F2, F1, B1, B2, B3 nantu à u genu di destinazione, è poi cuncepisce 4 primers basati nantu à queste 6 regioni specifiche (cum'è mostra in a figura sottu):

A prima interna in avanti (FIP) hè cumpostu di F1c è F2.

U primu internu in daretu (BIP) hè cumpostu di B1c è B2, è TTTT hè utilizatu cum'è spacer in u mezu.

I primers esterni F3 è B3 sò rispettivamente cumposti da regioni F3 è B3 nantu à u genu di destinazione.

In u sistema di reazzione LAMP, a cuncentrazione di u primer internu hè parechje volte quella di u primer esterno.U primu internu hè prima cumminatu cù u filamentu di u mudellu per sintetizà un filu cumplementariu per furmà un filu doppiu di DNA.In seguitu, u primer esterno hè cumminatu cù u filamentu di u mudellu per furmà una doppia fila di DNA.Sutta l'azzione di a polimerasi BstDNA, u filu cumplementariu sintetizatu da u primer internu hè liberatu.Dopu una seria di reazzioni, u filu cumplementariu forma infine un filu di DNA unicu cù una struttura dumbbell.

L'ADN di a struttura di dumbbell un filu singulu stessu hè utilizatu com'è mudellu per furmà continuamente una struttura di DNA transizionale cù una estremità aperta.I primers interni è esterni guidanu l'ADN di struttura transizionale di stem-loop per subisce continuamente reazioni di spostamentu è estensione di filamenti, è infine formanu strutture multiple di stem-loop cù lunghezze diverse.mischiu di DNA.

Vantaghji è disadvantages di l'amplificazione isotermica mediata da loop

Vantaghji di LAMP:

(1) Alta efficienza di amplificazione, chì pò amplificà in modu efficace 1-10 copie di u genu di destinazione in 1h, è l'efficienza di amplificazione hè 10-100 volte quella di a PCR ordinaria.

(2) U tempu di reazione hè cortu, a specificità hè forte, è ùn hè micca necessariu un equipamentu speciale.

I difetti di LAMP:

(1) I requisiti per i primi sò particularmente altu.

(2) U pruduttu amplificatu ùn pò micca esse usatu per a clonazione è a sequenza, ma pò esse solu per ghjudiziu.

(3) A causa di a so forte sensibilità, hè faciule di furmà aerosols, causendu falsi pusitivi è affettendu i risultati di a prova.

Samplificazione di spostamentu di trand

Strand displacement amplification (SDA) hè una tecnica di amplificazione isotermica di DNA in vitro basata nantu à a reazione enzimatica pruposta per a prima volta da u studiu americanu Walker in u 1992.

U sistema di basa di SDA include una endonucleasi di restrizzioni, una DNA polimerasi cù attività di spustamentu di filamenti, duie coppie di primers, dNTP, è ioni di calcium è magnesiu è sistemi buffer.

U principiu di l'amplificazione di spustamentu di filamentu hè basatu annantu à a sequenza di ricunniscenza di l'endonucleasi di restrizione modificata chimicamente à e duie estremità di u DNA di destinazione.L'endonucleasi apre u gap in u filu di DNA in u so situ di ricunniscenza, è l'ADN polimerasi estende u gap 3′ End è rimpiazzà u prossimu filu di DNA.

I filamenti singuli rimpiazzati di DNA pò esse cumminati cù primers è estesi in filamenti doppiu da DNA polimerasi.Stu prucessu hè ripetutu continuamente, perchè a sequenza di destinazione hè amplificata in modu efficiente.

Vantaghji è svantaghji di a tecnulugia di amplificazione di strand displacement

Vantaghji di SDA:

L'efficienza di amplificazione hè alta, u tempu di reazione hè cortu, a specificità hè forte, è ùn hè micca necessariu un equipamentu speciale.

I difetti di SDA:

I prudutti ùn sò micca uniformi, è certi prudutti unicu è doppia filamenti sò sempre pruduciuti in u ciculu SDA, è u tailing inevitabbilmente accade quandu hè rilevatu da l'elettroforesi.

Rolling circle amplification

Rolling circle amplification (RCA) hè pruposta da u metudu di copia di DNA da l'organismi patogeni per rolling circle.Si riferisce à l'usu di DNA circular monofila cum'è un mudellu à una temperatura constante, è una polimerasi DNA speciale (cum'è Phi29) ) Sottu l'azzione di a sintesi di DNA circular rolling per ottene l'amplificazione di u genu di destinazione.

RCA pò esse divisu in amplificazione lineare è amplificazione esponenziale.L'efficienza di RCA lineari pò ghjunghje sin'à 10⁵volte, è l'efficienza di RCA esponenziale pò ghjunghje à 10⁹volte.

Distinzione simplice, cum'è mostra in a figura sottu, l'amplificazione lineare a usa solu 1 primer, l'amplificazione esponenziale b hà 2 primers.

Linear RCA hè ancu chjamatu unicu primer RCA.Un primer si lega à l'ADN circular è hè allargatu da l'azzione di l'ADN polimerasi.U pruduttu hè un filu unicu lineale cù un gran numaru di sequenze ripetitive millaie di volte a durata di una sola loop.

Siccomu u pruduttu di RCA lineale hè sempre cunnessu à u primu di partenza, a fissazione faciule di u signale hè un vantaghju maiò.

RCA esponenziale, cunnisciuta ancu com'è Hyper amplificazione ramificata HRCA (Hyper ramificata RCA), in RCA esponenziale, un primer amplifica u pruduttu RCA, u secondu primer hibridizza cù u pruduttu RCA è si estende, è a sostituzione hè digià ligata à u pruduttu RCA.

I vantaghji è i disadvantages di l'amplificazione di l'acidu nucleicu rolling circle

Vantaghji di RCA:

Alta sensibilità, bona specificità è operazione faciule.

I difetti di RCA:

Problemi di fondo durante a rilevazione di signali.Duranti a reazione RCA, a sonda di lucagnu uncirculated è u mudellu DNA o RNA di a sonda liberata pò generà alcuni signali di fondo. 

Namplificazione basata in sequenza di ucleicacid

L'amplificazione basata in a sequenza di l'acidu nucleicu (NASBA) hè una nova tecnulugia sviluppata nantu à a basa di PCR.Hè una amplificazione cuntinuu è isotermale di l'acidu nucleicu guidata da un paru di primers cù una sequenza di promotore T7.A tecnulugia pò amplificà u mudellu RNA da circa 109 volte in circa 2 ore, chì hè 1000 volte più altu ch'è u metudu PCR convenzionale è ùn hà micca bisognu di equipaggiu speciale.

Sta tecnulugia hè stata aduprata per u diagnosticu rapidu di e malatie appena apparsu, è parechje cumpagnie utilizanu attualmente stu metudu in kits di rilevazione di RNA.

Ancu l'amplificazione di RNA pò ancu aduprà a tecnulugia PCR di trascrizione inversa, NASBA hà i so vantaghji: pò esse realizatu in cundizioni di temperatura relativamente custanti, è hè più stabile è precisa di a tecnulugia PCR tradiziunale.

A reazione hè à 41 gradi Celsius è richiede AMV (virus mieloblastosi aviaria) trascrittasi inversa, RNase H, T7 RNA polimerasi è un paru di primer per compie.

U prucessu include principalmente:

A prima prima cuntene a sequenza cumplementaria di u promotore T7.Duranti a reazione, u primer primariu si lega à u filamentu di l'RNA è hè catalizatu da l'enzima AMV per furmà una doppia catena DNA-RNA.

A RNase H digerisce l'RNA in l'ibridu à doppia fila è conserva l'ADN monocatenariu.

Sutta l'azzione di u primer inversu è di l'enzima AMV, si forma una doppia catena di DNA chì cuntene a sequenza di promotore T7.

Sutta l'azzione di T7 RNA polimerasi, u prucessu di trascrizzione hè cumpletu è una grande quantità di RNA di destinazione hè prodotta.

Vantaghji di NASBA:

(1) U so primer hà una sequenza di promotore T7, ma l'ADN straneru à doppia catena ùn hà micca sequenza di promotore T7 è ùn pò micca esse amplificatu, cusì sta tecnulugia hà una alta specificità è sensibilità.

(2) NASBA incorpora direttamente u prucessu di trascrizione inversa in a reazione di amplificazione, accurtendu u tempu di reazione.

Svantaghji di NASBA:

(1) I cumpunenti di reazzione sò più cumplicati.

(2) Trè tipi di enzimi sò richiesti per fà u costu di reazione più altu.