A PCR in tempu reale, cunnisciuta ancu com'è PCR quantitativa o qPCR, hè un metudu per u monitoraghju è l'analisi in tempu reale di i prudutti di amplificazione PCR.
Perchè a PCR quantitativa hà i vantaghji di un funziunamentu simplice, veloce è cunvene, alta sensibilità, bona ripetibilità è bassa rata di contaminazione, hè largamente utilizata in teste mediche, valutazione di l'efficacità di droghe, ricerca di espressione genica, ricerca transgénica, rilevazione di geni, rilevazione di patogeni, rilevazione di animali è piante., testi alimentarii è altri campi.
Dunque, sia siate impegnati in a ricerca basica in scienze di a vita, o impiegati di cumpagnie farmaceutiche, cumpagnie di allevamentu di animali, cumpagnie alimentari, o ancu impiegati di uffici di ispezione di entrata-uscita è di quarantena, dipartimenti di monitoraghju ambientale, ospedali è altre unità, sarete più o menu esposti à O avete bisognu di sapè a cunniscenza di maestru di PCR quantitativa.

Principiu di a PCR in tempu reale

A PCR in Tempu Reale hè un metudu in quale sustanzi fluorescenti sò aghjuntu à u sistema di reazione PCR, è l'intensità di u signale di fluoriscenza in u prucessu di reazione PCR hè monitorata in tempu reale da un strumentu PCR quantitativo, è infine i dati sperimentali sò analizati è processati.

【Curva di amplificazione】hè a curva chì descrive u prucessu dinamicu di PCR.A curva di amplificazione di a PCR ùn hè in realtà una curva esponenziale standard, ma una curva sigmoide.

[Fase di piattaforma di a curva di amplificazione]Cù l'aumentu di u nùmeru di cicli di PCR, l'inattivazione di l'ADN polimerasi, l'esaurimentu di dNTPs è primers, è l'inibizione di a reazione di sintesi da u pirofosfatatu di u pruduttu di a reazione, etc., a PCR ùn si espansione sempre in modu esponenziale., è eventualmente entrerà in un plateau.

[Regione di crescita esponenziale di a curva di amplificazione]Ancu s'è a fase di plateau varieghja assai, in una certa regione di a regione di crescita esponenziale di a curva di amplificazione, a ripetibilità hè assai bona, chì hè assai impurtante per l'analisi quantitativa di PCR.

[Valore di soglia è valore Ct]Avemu stabilitu u valore limite di a deteczione di fluoriscenza à a pusizione approprita in l'area di crescita esponenziale di a curva di amplificazione, vale à dì u valore di soglia (Threshold).L'intersezzione di u valore di u limitu è ​​a curva di amplificazione hè u valore Ct, vale à dì, u valore Ct si riferisce à u nùmeru di ciculi (Threshold Cycle) quandu u valore di u limitu hè righjuntu.

U graficu quì sottu mostra chjaramente a relazione trà a linea di soglia è a curva di amplificazione, u limitu è ​​u valore Ct.

【Cumu quantificà?】

Hè stata pruvata da a teoria matematica chì u valore Ct hà una relazione lineale inversa cù u logaritmu di u numeru di mudelli iniziali.Real Time PCR monitorizza i prudutti di amplificazione PCR in tempu reale è li quantifica durante a fase di amplificazione esponenziale.

Per ogni ciculu di PCR, l'ADN hà aumentatu esponenzialmente da 2 volte, è prestu righjuntu un plateau.

Assumendu chì a quantità di DNA di partenza hè A₀ , dopu à n cicli, a quantità teorica di u pruduttu di DNA pò esse espressa cum'è:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Allora, più a quantità iniziale di DNA A 0 hè, prima a quantità di u pruduttu amplificatu righjunghji u valore di rilevazione An , è u numeru di ciculi quandu ghjunghje à An hè u valore Ct.Vale à dì, più a quantità iniziale di DNA A 0 hè, prima i picchi di a curva di amplificazione, è u currispundente u numeru necessariu di cicli n hè più chjucu.

Facemu a diluzione di gradiente di u standard di cuncentrazione cunnisciuta è l'utilicemu cum'è un mudellu per a PCR in Tempu Reale, è una serie di curve di amplificazione serà ottenuta à intervalli uguali in l'ordine di a quantità di DNA iniziale da più à menu.Sicondu a relazione lineale trà u valore Ct è u logaritmu di u numeru di mudelli di partenza, a[curva standard] pò esse creatu.

Sustituendu u valore Ct di a mostra cun cuncentrazione scunnisciuta in a curva standard, a quantità iniziale di u mudellu di a mostra cun cuncentrazione scunnisciuta pò esse ottenuta, chì hè u principiu quantitatiu di a PCR in Tempu Reale.

Metudu di rilevazione di PCR in tempu reale

A PCR in Tempu Reale rileva i prudutti di amplificazione PCR rilevandu l'intensità di fluorescenza in u sistema di reazione.

Principiu di u Metudu d'Incrustazione di Tintura Fluorescente】

Coloranti fluorescenti, cum'è TB Green ® , pò unisce micca specificamente à l'ADN doppia filamentu in i sistemi PCR è fluoresce nantu à u ligame.

L'intensità di fluorescenza in u sistema di reazione aumenta in modu esponenziale cù l'aumentu di i cicli PCR.Detectendu l'intensità di fluorescenza, a quantità di amplificazione di DNA in u sistema di reazione pò esse monitorata in tempu reale, è poi a quantità di u mudellu di partenza in a mostra pò esse stimata inversamente.

【Principiu di u metudu di sonda fluorescente】

sonda fluorescentehè una sequenza di l'acidu nucleicu cù un gruppu fluorescente à l'estremità 5' è un gruppu di quenching à l'estremità 3', chì pò specificamente ligà à u mudellu.Quandu a sonda hè intacta, a fluoriscenza emessa da u fluoroforu hè spenta da u gruppu di quenching è ùn pò micca fluoresce.Quandu a sonda hè decomposta, a sustanza fluorescente dissociarà è emetterà fluoriscenza.

Una sonda fluorescente hè aghjuntu à a suluzione di reazione PCR.Durante u prucessu di annealing, a sonda fluorescente si ligherà à a pusizione specifica di u mudellu.Durante u prucessu di estensione, l'attività exonuclease 5'→3' di l'enzima PCR pò decompone a sonda fluorescente hibrida cù u mudellu, è a sustanza fluorescente hè dissociata per emette fluorescenza.Detectendu l'intensità di fluorescenza di a sonda in u sistema di reazione, u scopu di monitorizà a quantità di amplificazione di u pruduttu PCR pò esse rializatu.

【Selezzione di u Metudu di Deteczione di Fluorescenza】

S'ellu hè adupratu per distingue e sequenze cù alta omologia è eseguisce a deteczione di PCR multiplex cum'è l'analisi di typing SNP, u metudu di sonda fluorescente hè insustituibile.
Per altri esperimenti di PCR in Tempu Reale, pò esse usatu un metudu chimera fluorescente simplice, faciule è di prezzu.

sondeSpecificità forte, capace di PCR multiplex

Mancanza

Requisiti di alta specificità per l'amplificazione;

A PCR multiplex ùn pò esse realizatu. Necessità di cuncepisce sonde specifiche, costu altu;

qualchì volta u disignu di a sonda hè difficiule

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