U valore Ct hè a forma di presentazione di u risultatu più impurtante di a PCR quantitativa fluorescente.Hè utilizatu per calculà e differenze di l'espressione genica o u numeru di copia di genu.Allora chì hè u valore Ct di quantificazione di fluoriscenza cunzidiratu raghjone?Cumu assicurà a gamma efficace di u valore Ct?
Chì ghjè u valore Ct?
Durante u prucessu di amplificazione qPCR, u numeru currispundente di cicli di amplificazione (Cycle Threshold) quandu u signale di fluoriscenza di u pruduttu amplificatu righjunghji u sogliu di fluoriscenza stabilitu.C sta per Cycle è T sta per Threshold.Simply put, u valore Ct hè u numeru di ciculi chì currispondenu à quandu l'amplificazione di u mudellu iniziale righjunghji una certa quantità di pruduttu in qPCR.U cusì chjamatu "una certa quantità di pruduttu" serà più spiegatu dopu.
Chì faci u valore Ct?
1. Relazione trà amplificazione esponenziale, quantità di mudellu è valore Ct
Ideale, i geni in qPCR sò accumulati da amplificazione esponenziale dopu un certu numaru di ciculi.A relazione trà u numeru di ciculi di amplificazione è a quantità di prudutti hè: quantità di produttu amplificata = quantità iniziale di u mudellu × (1 + En) numeru di ciculi.Tuttavia, a reazione qPCR ùn hè micca sempre in una situazione ideale.Quandu a quantità di u pruduttu amplificatu righjunghji un "certu quantità di produttu", u numeru di ciculi in questu tempu hè u valore Ct, è hè in u periodu di amplificazione esponenziale.A relazione trà u valore Ct è a quantità di u mudellu di partenza: Ci hè una relazione lineale trà u valore Ct di u mudellu è u logaritmu di u numeru di copia iniziale di u mudellu.A più alta a cuncentrazione iniziale di u mudellu, u più chjucu u valore Ct;più bassa hè a cuncentrazione iniziale di u mudellu, più grande u valore Ct.
2.Curva di amplificazione, soglia di fluoriscenza è certa quantità di produttu PCR
A quantità di u pruduttu di amplificazione qPCR hè presentata direttamente in forma di signali fluorescenti, vale à dì a curva di amplificazione.In u primu stadiu di a PCR, l'amplificazione hè in cundizioni ideali, u nùmeru di ciculi hè chjuca, l'accumulazione di u produttu hè chjuca, è u livellu di fluoriscenza ùn pò esse chjaramente distintu da u fondu di fluoriscenza.Dopu quì, a fluoriscenza aumenta è entra in a fase esponenziale.A quantità di u pruduttu PCR pò esse rilevatu in un certu puntu quandu a reazione PCR hè ghjustu in a fase esponenziale, chì pò esse usata cum'è "una certa quantità di pruduttu", è u cuntenutu iniziale di u mudellu pò esse deduciutu da questu.Dunque, l'intensità di u signale di fluoriscenza chì currisponde à una certa quantità di pruduttu hè u sogliu di fluoriscenza.
In u stadiu tardu di a PCR, a curva di amplificazione ùn mostra più amplificazione esponenziale, è entra in a fase lineale è a fase di plateau.
3.Reproducibility di i valori Ct
Quandu u ciculu PCR righjunghji u numeru di u ciculu di u valore Ct, hè ghjustu intrutu in u veru periodu di amplificazione esponenziale.À questu tempu, u picculu errore ùn hè micca amplificatu, cusì a riproducibilità di u valore Ct hè excelente, vale à dì, u stessu mudellu hè amplificatu in tempi diffirenti o in tubi differenti à u stessu tempu.Amplificazione, u valore Ct ottenutu hè constantu.
1.Amplification efficienza En
L'efficienza di amplificazione PCR si riferisce à l'efficienza cù quale a polimerasi cunverte u genu per esse amplificatu in un amplicon.L'efficienza di amplificazione quandu una molècula di DNA hè trasfurmata in duie molécule di DNA hè 100%.L'efficienza di amplificazione hè comunmente espressa cum'è En.Per facilità l'analisi di l'articuli successivi, i fatturi chì affettanu l'efficienza di amplificazione sò brevemente introduttu.
| Fattori chì influenzanu | spiegazione | Cumu ghjudicà ? |
| A. Inibitori di PCR | 1. U mudellu DNA cuntene sustanzi chì impediscenu a reazzione PCR, cum'è proteini o detergenti.2. U cDNA dopu a trascrizzione inversa cuntene una alta cuncentrazione di cumpunenti di reagenti di RNA di mudellu o RT, chì pò ancu inibisce a reazzione PCR successiva. | 1. S'ellu ci hè a contaminazione pò esse ghjudicatu da a misurazione di u rapportu di A260 / A280 è A260 / A230 o RNA electrophoresis.2. Sia u cDNA hè diluted sicondu un certu rapportu dopu a trascrizzione inversa. |
| B. Disegnu di prima impropriu | I primi ùn anu micca anneal in modu efficace | Verificate i primers per i primer-dimeri o forcine per capelli, mancanze, è à volte spanning designs intrronici. |
| C. Cuncepimentu di prugramma di reazzione di PCR impropriu | 1. Primers ùn pò micca effittivamenti anneal2. Liberazione insufficiente di DNA polimerasi 3. L'attività di l'ADN polimerasi d'alta temperatura à longu andà diminuite | 1. A temperatura di annealing hè più altu ch'è u valore TM di u primu2. U tempu di pre-denaturazione hè troppu cortu 3. U tempu di ogni tappa di a prucedura di reazzione hè troppu longa |
| D. Insufficient mixing of reagents or pipetting errors | In u sistema di reazzione, a cuncentrazione lucale di cumpunenti di reazione PCR hè troppu alta o irregolare, risultatu in amplificazione non-esponenziale di amplificazione PCR. | |
| E. Amplicon Length | A durata di l'amplicon hè troppu longa, sopra à 300bp, è l'efficienza di amplificazione hè bassa | Verificate chì a durata di l'amplicon hè trà 80-300bp |
| F. Influenza di i reagenti qPCR | A cuncentrazione di l'ADN polimerasi in u reagentu hè bassa o a cuncentrazione di ioni in u buffer ùn hè micca ottimizzata, risultatu in l'attività di l'enzima Taq chì ùn ghjunghje micca u massimu. | Determinazione di l'efficienza di amplificazione da a curva standard |
2.Range di valori Ct
I valori Ct varienu da 15-35.Se u valore Ct hè menu di 15, hè cunsideratu chì l'amplificazione hè in u intervalu di u periodu di basa è u limitu di fluoriscenza ùn hè micca righjuntu.Ideale, ci hè una relazione lineale trà u valore Ct è u logaritmu di u numeru di copia iniziale di u mudellu, vale à dì a curva standard.Per mezu di a curva standard, quandu l'efficienza di l'amplificazione hè 100%, u valore Ct calculatu per quantifying u numeru di copia unica di u genu hè intornu à 35. S'ellu hè più grande di 35, u numeru di copia iniziale di u mudellu hè teoricamente menu di 1, chì pò esse cunsideratu senza significatu.
Per diversi intervalli di gene Ct, per via di a diffarenza in u numeru di copia di u gene è l'efficienza di amplificazione in a quantità iniziale di u mudellu, hè necessariu di fà una curva standard per u genu è calculà a gamma di deteczione lineale di u genu.
3.Influencing fattori di u valore Ct
Da u rapportu trà u numeru di ciculi amplification è a quantità di prodottu: quantità di prodottu amplified = quantità di mudellu iniziale × (1 + En) numeru ciclu, si pò vede chì in cundizioni ideali, a quantità di mudellu iniziale è En vi hannu un impattu negativu nant'à u valore Ct hè affettatu.A diferenza in a qualità di u mudellu o l'efficienza di amplificazione farà chì u valore Ct sia troppu grande o troppu chjucu.
4.Ct valore hè troppu grande o troppu picculu
Tempu di Postu: Feb-22-2023
