A tecnulugia di diagnostica moleculare usa i metudi di biologia moleculare per detectà l'espressione è a struttura di u materiale geneticu di u corpu umanu è diversi patogeni, in modu di ottene u scopu di predichendu è diagnosticà e malatie.

Nta l'ultimi anni, cù l'aghjurnamentu è l'iterazione di a tecnulugia di diagnostica moleculare, l'applicazione clinica di diagnostica moleculare hè diventata sempre più estensiva è in profonda, è u mercatu di diagnostica moleculare hè intrutu in un periodu di rapidu sviluppu.

L'autore riassume i tecnulugii di diagnostichi moleculari cumuni nantu à u mercatu, è hè divisu in trè parte: a prima parte introduce a tecnulugia PCR, a seconda parte introduce a tecnulugia di amplificazione isotermica di l'acidu nucleicu, è a seconda parte introduce a tecnulugia di sequenza.

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Parte I: Tecnulugia PCR

tecnulugia PCR

A PCR (reazione in catena di polimerasi) hè una di e tecnulugia di amplificazione di DNA in vitro, cù una storia di più di 30 anni.

A tecnulugia PCR hè stata pioniera in u 1983 da Kary Mullis di Cetus, USA.Mullis hà dumandatu un brevettu PCR in u 1985 è hà publicatu u primu documentu accademicu PCR nantu à a Scienza in u stessu annu.Mullis hà vintu u Premiu Nobel in Chimica in u 1993.

Principi basi di PCR

A PCR pò amplificà i frammenti di DNA di destinazione più di un milione di volte.U principiu hè chì sottu a catalisi di l'ADN polimerasi, l'ADN di u filu parentale hè utilizatu com'è mudellu, è un primer specificu hè utilizatu com'è puntu di partenza per l'estensione.Hè riplicatu in vitro attraversu passi cum'è a denaturazione, l'annealing è l'estensione.U prucessu di l'ADN di filamentu figliu cumplementarii à l'ADN mudellu di filamentu parent.

U prucessu standard di PCR hè divisu in trè fasi:

1. Denaturation: Aduprà alta temperatura per separà DNA doppia filamenti.I ligami di l'idrogenu trà i filamenti doppiu di l'ADN sò rotti à alta temperatura (93-98 ° C).

2. Annealing: Dopu chì l'ADN duppiu-stranded hè siparatu, a temperatura hè abbassata in modu chì u primer pò ligà à l'ADN single-stranded.

3. Estensione: L'ADN polimerasi cumencia à sintetizà filamenti cumplementarii longu i filamenti di DNA da i primeri ligati quandu a temperatura hè abbassata.Quandu l'estensione hè cumpleta, un ciculu hè cumpletu, è u nùmeru di frammenti di DNA duppiu.

Reciprocate sti trè passi 25-35 volte, u numeru di frammenti di DNA cresce in modu esponenziale.

L'ingenuità di a PCR hè chì diversi primers ponu esse disignati per diversi geni di destinazione, perchè i frammenti di geni di destinazione ponu esse amplificati in pocu tempu.

Finu a ora, a PCR pò esse divisa in trè categurie, à dì PCR ordinariu, PCR quantitativa fluorescente è PCR digitale.

A prima generazione di PCR ordinariu

Aduprate un strumentu d'amplificazione PCR ordinariu per amplificà u genu di destinazione, è dopu aduprate l'elettroforesi di gel d'agarose per detectà u pruduttu, solu l'analisi qualitativa pò esse fatta.

I principali svantaghji di a prima generazione di PCR:

-Propensu à l'amplificazione non specifica è risultati falsi pusitivi.

-A deteczione piglia assai tempu è l'operazione hè ingombrante.

-Solu teste qualitative pò esse fattu.

PCR quantitativa di fluorescenza di seconda generazione

A PCR quantitativa di fluorescenza (PCR in tempu reale), cunnisciuta ancu cum'è qPCR, hè aduprata per monitorà l'accumulazione di prudutti amplificati attraversu l'accumulazione di signali fluorescenti aghjunghjendu sonde fluorescenti chì ponu indicà u prugressu di u sistema di reazione, è per ghjudicà i risultati attraversu a curva di fluorescenza, è pò esse quantificatu cù l'aiutu di u valore Cq è a curva standard.

Perchè a tecnulugia qPCR hè realizata in un sistema chjusu, a probabilità di contaminazione hè ridutta, è u signale di fluoriscenza pò esse monitoratu per a deteczione quantitativa, per quessa hè u più utilizatu in a pratica clinica è hè diventatu a tecnulugia dominante in PCR.

I sustanzi fluorescenti utilizati in a PCR quantitativa fluorescente in tempu reale ponu esse divisi in: sonde fluorescenti TaqMan, balise moleculari è coloranti fluorescenti.

1) Sonda fluorescente TaqMan:

Durante l'amplificazione PCR, una sonda fluorescente specifica hè aghjuntu mentre aghjunghje un paru di primers.A sonda hè un oligonucleotide, è e duie estremità sò rispettivamente marcate cù un gruppu fluorescente reporter è un gruppu fluorescente quencher.

Quandu a sonda hè intacta, u signale fluoriscente emessu da u gruppu di reporter hè assorbita da u gruppu di quenching;durante l'amplificazione di PCR, l'attività di l'esonucleasi 5′-3′ di l'enzima Taq scinde è degrada a sonda, facendu u gruppu fluorescente reporter è quencher U gruppu fluorescente hè separatu, in modu chì u sistema di monitoraghju di fluorescenza pò riceve u signale di fluorescenza, vale à dì, ogni volta chì un filu di DNA hè amplificatu, una furmazione di fluorescenza hè cumpletamente sincronizzata. u pruduttu PCR.

2) Coloranti fluorescenti SYBR:

In u sistema di reazione PCR, un eccessu di tintura fluorescente SYBR hè aghjuntu.Dopu chì a tintura fluorescente SYBR ùn hè micca specificamente incorporata in a doppia fila di DNA, emette un signalu fluorescente.A molècula di tintura SYBR chì ùn hè micca incorporata in a catena ùn emetterà alcun signale fluoriscente, assicurendu cusì u signale fluoriscente L'aumentu di i prudutti di PCR hè cumpletamente sincronizatu cù l'aumentu di i prudutti di PCR.SYBR si unisce solu à l'ADN à doppia fila, cusì a curva di fusione pò esse usata per stabilisce se a reazione PCR hè specifica.

3) Fari moleculari

Hè una sonda di oligonucleotide doppiu-labelled di stem-loop chì forma una struttura di hairpin di circa 8 basi à l'estremità 5 è 3.E sequenze di l'acidu nucleicu à e duie estremità sò cumplementarii accoppiate, facendu chì u gruppu fluorescente è u gruppu di quenching sò stretti.Close, ùn pruducerà micca fluoriscenza.

Dopu chì u pruduttu PCR hè generatu, durante u prucessu di annealing, a parte media di u faro moleculare hè assuciatu cù una sequenza di DNA specifica, è u genu fluorescente hè siparatu da u gene quencher per pruduce fluorescenza.

I principali svantaghji di a PCR di seconda generazione:

A sensibilità hè sempre mancante, è a deteczione di specimens low-copy ùn hè micca precisa.

Ci hè una influenza di valore di fondo, è u risultatu hè suscettibile à l'interferenza.

PCR digitale di terza generazione

A PCR digitale (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) calcula u numeru di copia di a sequenza di destinazione attraversu a rilevazione di u puntu finale, è pò realizà una rilevazione quantitativa assoluta precisa senza aduprà cuntrolli interni è curve standard.

A PCR digitale usa a rilevazione di l'endpoint è ùn dipende micca da u valore Ct (soglia di ciclu), cusì a reazione di PCR digitale hè menu affettata da l'efficienza di amplificazione, è a tolleranza à l'inibitori di a reazione PCR hè migliurata, cù alta precisione è riproducibilità.

A causa di e caratteristiche di alta sensibilità è alta precisione, ùn hè micca facilmente interferitu da inhibitori di reazzione PCR, è pò ottene una vera quantificazione assoluta senza prudutti standard, chì hè diventatu un hotspot di ricerca è applicazione.

Sicondu e diverse forme di l'unità di reazzione, pò esse divisa in trè tippi: sistemi microfluidic, chip è droplet.