In l'esperimenti qPCR, u disignu di primer hè ancu un ligame assai impurtante.Sia chì i primi sò adattati o micca, hè strettamente ligatu à se l'efficienza di amplificazione righjunghji u standard, se i prudutti amplificati sò specifichi, è se i risultati sperimentali sò dispunibili.
Allora cumu fà megliu a specificità di u primer qPCR?Alta efficienza di amplificazione?
Oghje, vi purteremu à cuncepisce i primers qPCR inseme, è lasciate chì u disignu di u primu qPCR diventenu una cumpetenza di tradizione efficiente in esperimenti.
Quandu cuncepisce i primers qPCR, generalmente fate attenzione à i seguenti punti: i primers duveranu esse disignati à traversu introni quant'è pussibule, a lunghezza di u pruduttu deve esse 100-300 bp, u valore Tm deve esse u più vicinu pussibule à 60 ° C, è i primers upstream è downstream deve esse u più vicinu pussibule, è a fine di u primer deve esse G o C, etc.
1. Disegnu di primers chì copre introni
Quandu cuncepisce i primers qPCR, a scelta di primers cuncepiti à traversu introni pò impedisce chì u mudellu di gDNA sia amplificatu, è i prudutti sò tutti derivati ​​da l'amplificazione di cDNA, eliminendu cusì l'influenza di a contaminazione gDNA.
2. Lunghezza di prima
A durata di prima hè generalmente trà 18-30 nt, è a durata di u pruduttu di amplificazione deve esse cuntrullata trà 100-300 bp quantu pussibule.
Se u primer hè troppu cortu, porta à l'amplificazione non specifica, è s'ellu hè troppu longu, facilmente formarà a struttura secundaria (cum'è a struttura di hairpin).Se u pruduttu di amplificazione hè troppu longu, ùn hè micca adattatu per a reazione di polimerasi, chì affettarà l'efficienza di l'amplificazione PCR.
3. cuntenutu GC è valore Tm
U cuntenutu GC di primers deve esse cuntrullatu trà 40% è 60%.S'ellu hè troppu altu o troppu bassu, ùn hè micca favurevule per inizià a reazione.Le contenu en GC des amorces avant et inverse doit être proche du même pour obtenir la même valeur de Tm et la même température de recuit.
U valore Tm deve esse trà 55-65 ° C quant'è pussibule, in generale intornu à 60 ° C, è u valore Tm di l'upstream è downstream deve esse u più vicinu pussibule, preferibile micca più di 4 ° C.
4. Evitate di selezziunà A à l'estremità 3' di u primer
Quandu l'estremità 3' di u primer hè mistched, ci sò grandi diffirenzii in l'efficienza di sintesi di diverse basi.Quandu l'ultima basa hè A, pò ancu inizià a sintesi di a catena ancu in u casu di misatching, è quandu l'ultima basa hè T Quandu, l'efficienza di l'induzione di misat hè assai ridutta.Dunque, pruvate d'evità di sceglie A à l'estremità 3' di u primer, è hè megliu sceglie T.
S'ellu hè un primu sonda, l'estremità 5' di a sonda ùn pò micca esse G, perchè ancu quandu una sola basa G hè cunnessa à u gruppu di reporter fluoriscenti FAM, G pò ancu quench u signale fluoriscente emessu da u gruppu FAM, risultatu in falsi risultati negativi.Apparisce.
5. Distribuzione di basa
A distribuzione di e quattru basi in u primer hè preferibile casuale, evitendu più di 3 G o C consecutivi à l'estremità 3', è più di 3 consecutivi.G o C sò faciuli di generà accoppiamentu in a regione di sequenza ricca di GC.
6. A regione di cuncepimentu di u primu deve evità strutture secundarie cumplesse.
A struttura secundaria formata da a sola fila di u pruduttu di amplificazione affetterà u prugressu lisu di a PCR.Per predice s'ellu ci hè una struttura secundaria in a sequenza di destinazione in anticipu, pruvate d'evità sta regione in u disignu di primers.
7. I primers stessi è trà i primers anu da pruvà à evitari basi cumplementarii consecutivi.
Ùn ci pò esse una complementarità consecutiva di 4 basi trà u primer stessu è u primer.U primu stessu ùn deve micca avè una sequenza cumplementaria, altrimente si plegarà per furmà una struttura di hairpin, chì affettarà a cumminazzioni di annealing di u primu è u mudellu.
Sequenze cumplementarii ùn ponu micca esistenu trà i primers upstream è downstream.A cumplementarità trà i primers pruducerà dimeri di primer, chì riduceranu l'efficienza di a PCR è ancu affettanu a precisione quantitativa.Se i strutturi di primer-dimer è hairpin sò inevitabbili, u valore △G ùn deve esse troppu altu (duve esse menu di 4,5 kcal / mol).
8. I primers amplificanu u pruduttu specificu di destinazione.
L'ultimu scopu di a rilevazione di qPCR hè di capisce l'abbundanza di u genu di destinazione.Se si verifica una amplificazione non specifica, a quantificazione serà imprecisa.Per quessa, dopu chì i primi sò designati, anu da esse pruvati da BLAST, è a specificità di i prudutti hè paragunata in a basa di dati di sequenza.
In seguitu, pigliamu u genu umanu GAS6 (Growth arrest specific 6) cum'è un esempiu per cuncepisce primer qPCR.
01 gene di dumanda
Homo GAS6à travers l'NCBI.Quì, duvemu attente à paragunà u nome di u genu è l'spezie per assicurà chì sò cunsistenti.
02 Truvate a sequenza di geni
(1) Se a sequenza di destinazione hè DNA genomicu, selezziunate u primu, chì hè a sequenza di DNA genomicu di u genu.
(2) Se a sequenza di destinazione hè mRNA, selezziunate a seconda.Dopu avè intrutu, cliccate "CDS" in a tavola sottu.A sequenza di fondo marrone hè a sequenza codificante di u genu.
03 Disegnu primers
Entra in l'interfaccia Primer-BLAST
Inserite u numeru di sequenza di u gene o a sequenza in u furmatu Fasta in u cima manca, è inserite i paràmetri pertinenti.

Cliccate "Get primers" è NCBI appariscerà per dì chì una tale selezzione di parametri serà amplificata à altre varianti di splicing.Pudemu cuntrollà e diverse varianti di splicing è sottumettenu per ottene u paru di primer apprupriatu (cum'è mostra in a figura sottu).Stu prucessu pò piglià decine di seconde per correre.
A temperatura di l'annealing di queste coppie di primer sò tutte circa 60 ° C.Sicondu u scopu di l'esperimentu, sceglite primers cù una durata moderata, una bona specificità è menu autocumplementazione di i primi per l'esperimentu, è a rata di successu hè abbastanza alta!
04 Verificazione di specificità di u primu
In fattu, in più di cuncepisce i primeri, Primer-Blast pò ancu evaluà i primeri chì avemu designatu noi stessi.Riturnà à a pagina di cuncepimentu di u primu, entre in i primers upstream è downstream chì avemu disignatu, è altri parametri ùn saranu micca aghjustati.Dopu sottumessu, pudete vede s'ellu u paru di primers esiste ancu in altri genes.Sì tutti sò affissati nantu à u genu chì vulemu amplificà, indicà chì a specificità di stu paru di primers hè grande!(Per esempiu, questu hè l'unicu risultatu di a dumanda di prima!)

05 Giudiziu di qualità di prima
Chì tipu di primer hè u primer "perfettu" chì combina "efficienza di amplificazione finu à u standard", "caratteristiche di u produttu amplificatu" è "risultati sperimentali affidabili"?
Efficienza di amplificazione

curva di fusione
L'efficienza di amplificazione di i primers righjunghji 90% -110%, chì significa chì l'efficienza di amplificazione hè bona, è a curva di fusione hà una sola punta è di solitu Tm> 80 ° C, chì significa chì a specificità di amplificazione hè bona.
 
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