A PCR quantitativa di fluorescenza (cunnisciutu ancu TaqMan PCR, in seguitu chjamata FQ-PCR) hè una nova tecnulugia quantitativa di l'acidu nucleicu sviluppata da PE (Perkin Elmer) in i Stati Uniti in 1995. Sta tecnulugia hè basata nantu à PCR cunvinziunali aghjunghjendu sonde fluorescenti marcati.Comparatu cù a PCR flexible, FQ-PCR hà assai vantaghji per realizà a so funzione quantitativa.Questu articulu hà da descriverà brevemente e caratteristiche, i principii, i metudi è l'applicazioni di a tecnulugia.
1 Caratteristiche
FQ-PCR ùn hè micca solu l'alta sensibilità di a PCR ordinaria, ma ancu per via di l'applicazione di sonde fluorescenti, pò detectà direttamente u cambiamentu di signale fluorescente durante l'amplificazione di PCR per mezu di u sistema di cunduzione fotoelettrica per ottene risultati quantitativi, chì supera assai difetti di a PCR convenzionale, cusì hà ancu l'alta specificità di l'ibridazione di DNA è l'alta precisione di a tecnulugia di spettroscopia.
Per esempiu, i prudutti generali di PCR devenu esse osservati per l'elettroforesi di gel d'agarose è a tintura di bromuru d'etidium cù luce ultravioletta o per l'elettroforesi di gel di poliacrilamide è a tintura d'argentu.Questu ùn hè micca solu bisognu di parechji strumenti, ma ancu di tempu è sforzu.E macchie usate Ethidium bromure sò dannusu à u corpu umanu, è sti prucedure spirimintali cumplicati furniscenu opportunità per a contaminazione è falsi pusitivi.Tuttavia, FQ-PCR hà bisognu di apre u coperchio una volta durante a carica di mostra, è u prucessu sussegwente hè un funziunamentu di tubu completamente chjusu, chì ùn hà micca bisognu di post-processamentu di PCR, evitendu parechji inconvenienti in l'operazioni PCR convenzionali.L'esperimentu generalmente usa u termociclatore ABI7100 PCR sviluppatu da a cumpagnia PE.
U strumentu hà e seguenti caratteristiche: ① Ampia applicazione: pò esse aduprata per a quantificazione di u produttu PCR di DNA è RNA, ricerca di l'espressione genica, rilevazione di patogeni è ottimisazione di e cundizioni PCR.② Principiu quantitatiu unicu: Utilizendu sonde fluorescenti marcate, a quantità di fluorescenza s'accumulerà cù u ciclu di PCR dopu l'eccitazione laser, in modu di ottene u scopu di quantificazione.③ Alta efficienza di travagliu: Ciclatore termicu 9600 PCR integratu, cuntrullatu da l'urdinatore da 1 à 2 ore per compie l'amplificazione è a quantificazione di 96 campioni automaticamente è sincronamente.④ Ùn ci hè bisognu di l'elettroforesi in gel: Ùn ci hè bisognu di diluisce è elettroforesi u campione, basta aduprà una sonda speciale per detectà direttamente in u tubu di reazione.⑤Nisuna contaminazione in u pipeline: U tubu di reazione unicu cumpletamente chjusu è u sistema di cunduzzione fotoelettrica sò aduttati, cusì ùn ci hè bisognu di preoccupassi di a contaminazione.⑥I risultati sò riproducibili: a gamma dinamica quantitativa hè finu à cinque ordini di grandezza.Dunque, postu chì sta tecnulugia hè stata sviluppata cù successu, hè stata valutata da parechji circadori scientifichi è hè stata appiicata in parechji campi.
2 Principi è metudi
U principiu di travagliu di FQ-PCR hè di utilizà l'attività exonuclease 5'→3' di l'enzima Taq per aghjunghje una sonda marcata fluorescente à u sistema di reazione PCR.A sonda pò hibridà specificamente cù u mudellu di DNA cuntenutu in a sequenza di primer.L'estremità 5' di a sonda hè etichettata cù u gene di emissione di fluorescenza FAM (6-carbossifluoresceina, picco di emissione di fluorescenza a 518 nm), è l'estremità 3' hè etichettata cù u gruppu di estinzione di fluorescenza TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, 5-carboxytetramethylrhodamine, a sonda di emissione di fluorescenza di 5832' è etichettata in 5-832'). impediscenu l'estensione di a sonda durante l'amplificazione PCR.Quandu a sonda resta intacta, u gruppu di quencher supprime l'emissione di fluorescenza di u gruppu emittente.Quandu u gruppu emittente hè separatu da u gruppu di quenching, l'inibizione hè elevata, è a densità ottica à 518nm aumenta è hè rilevata da u sistema di rilevazione di fluorescenza.Quandu a sonda hè tagliata, l'effettu di quenching hè liberatu è u signale fluorescente hè liberatu.Ogni volta chì u mudellu hè copiatu, una sonda hè tagliata, accumpagnata da a liberazione di un signalu fluoriscente.Siccomu ci hè una relazione unu à unu trà u numeru di fluorofori liberati è u numeru di prudutti PCR, sta tecnica pò esse usata per quantificà accuratamente u mudellu.U strumentu spirimintali usa in generale u ABI7100 PCR thermal cycler sviluppatu da a cumpagnia PE, è altri termociclatori ponu ancu esse usatu.Se u sistema di reazzione di u tipu di reazzione ABI7700 hè utilizatu per l'esperimentu, dopu chì a reazzione hè cumpleta, i risultati quantitativi ponu esse direttamente datu per l'analisi di l'urdinatore.Se aduprate altri termociclatori, avete bisognu di utilizà un detector di fluoriscenza per misurà u signale di fluoriscenza in u tubu di reazione à u stessu tempu per calculà RQ+, RQ-, △RQ.RQ + rapprisenta u rapportu di l'intensità di luminescenza di u gruppu di emissione fluorescente di u tubu di mostra à l'intensità di luminescenza di u gruppu di quenching, RQ- rapprisenta u rapportu di i dui in u tubu in biancu, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) rapprisenta a quantità di cambiamentu di signale di fluorescenza durante a PCR.A causa di l'intruduzioni di sonde fluorescenti, a specificità di l'esperimentu hè significativamente mejorata.U disignu di a sonda deve generalmente risponde à e seguenti cundizioni: ①A durata di a sonda deve esse circa 20-40 basi per assicurà a specificità di u ligame.②U cuntenutu di e basi GC hè trà 40% è 60% per evità a duplicazione di sequenze di nucleotidi unichi.③ Evite l'ibridazione o sovrapposizione cù primers.④ La stabilité de la liaison entre la sonde et le modèle est supérieure à celle de la liaison entre l'amorce et le modèle, donc la valeur Tm de la sonde doit être d'au moins 5 °C plus élevée que la valeur Tm de l'amorce.Inoltre, a cuncentrazione di a sonda, l'omologia trà a sonda è a sequenza di u mudellu, è a distanza trà a sonda è u primer anu un impattu nantu à i risultati sperimentali.
I prudutti cunnessi:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Manufacturer and Supplier |Foregene (foreivd.com)
Tempu di pubblicazione: 15 ottobre 2021
