A PCR diretta hè una reazione chì usa direttamente tessuti animali o vegetali per l'amplificazione senza estrazione di l'acidu nucleicu.In parechji modi, a PCR diretta funziona cum'è a PCR regulare

A principal diferenza hè u buffer persunalizatu utilizatu in a PCR diretta, a mostra pò esse direttamente sottumessa à a reazzione PCR senza estrazione di l'acidu nucleicu, ma ci sò esigenze currispundenti per a tolleranza di l'enzimi è a cumpatibilità di u buffer implicatu in a reazione PCR diretta.

Ancu s'ellu ci sò più o menu inhibitori di PCR in campioni cumuni, a PCR diretta pò ancu ottene una amplificazione affidabile sottu l'azzione di enzimi è buffers.A reazione PCR tradiziunale richiede l'acidu nucleicu d'alta qualità cum'è un mudellu, chì pò impedisce u prugressu lisu di a reazione PCR se u mudellu cuntene proteini è altre impurità.A PCR diretta hè attualmente una di e tecnulugia più populari in u campu di diagnostichi moleculari.

01 A PCR diretta hè stata aduprata in origine per l'animali è a pianta

A prima applicazione di PCR diretta hè in u campu di l'animali è di e piante, cum'è u sangue, i tessuti è i capelli di u ratu, gattu, pollo, cunigliu, pecuri, vacche, etc., foglie di piante è sementi, ecc.

Questi campi anu qualchi caratteristiche cumuni, vale à dì, u cuntenutu di u gene di destinazione hè relativamente altu è l'estrazione di l'acidu nucleicu hè fastidiosa, cusì a PCR diretta ùn pò micca solu risparmià tempu è avè un picculu impattu nantu à i risultati, ma ancu risparmià u costu.

A PCR diretta utilizata per a rilevazione di patogeni hè una materia di l'ultimi anni, certi pruduttori di reagenti PCR anu fattu assai sforzi in questa direzzione quandu facenu innuvazione.In particulare in questa epidemia di COVID-19, parechji tali prudutti di rilevazione sò apparsu nantu à u mercatu, cum'è SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) ricercatu è sviluppatu da Foregene, chì usa a tecnulugia RT PCR in tempu reale (rRT-PCR) per a rilevazione qualitativa di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 o di l'acidu nucleico umanu. s.

Foregene hè una di e cumpagnie chì utilizanu a tecnulugia di PCR diretta, per a rilevazione di ORF1ab, N, E è normale.varianti lignages nucleic acids in u nasopharyngeal o oropharyngeal samples swab umanu cum'è SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (UK), lineage B.1.351 (ZA), lineage B.1.617 (IND) è lineage P.1 (BR).

02  Reagenti necessarii per a PCR diretta

Lisate di mostra

U lisatu di mostra pò esse cunfiguratu da sè stessu o acquistatu.A diffarenza in a cumpusizioni di e diverse marche di lisatu farà a capacità di lisazione diversa, è dopu u tempu di lisazione serà un pocu sfarente.Per esempiu, per a preparazione di campioni di tissuti animali, 30 minuti o lisi di notte hè generalmente cunsigliatu, è a suluzione di lisi per virus varieghja da 3-10 minuti.

Master mix PCR

Hè cunsigliatu di utilizà l'ADN polimerasi hot-start per rinfurzà l'amplificazione specifica è aumentà a capacità di amplificazione.U core di a PCR diretta hè una polimerasi altamente tolerante.

Eliminate o inibisce i cumpunenti in a mostra chì affettanu l'amplificazione di DNA

Dopu chì a mostra hè trattata cù u lisatu, i proteini, i lipidi è altri detriti cellulari seranu liberati, queste sustanzi inibiscenu a reazione PCR.Per quessa, a PCR diretta richiede l'aghjunzione di a rimozione currispondente o inhibitori per riduce l'influenza di sti fattori.

03  Una cullizzioni di cinque punti di cunniscenza di PCR diretta

Prima, a tecnulugia PCR diretta hè una tecnulugia PCR diretta per varii campioni biologichi.Sutta sta cundizione tecnica, ùn ci hè micca bisognu di separà è estratti l'acidu nucleicu, aduprà direttamente a mostra di tissutu cum'è l'ughjettu, è aghjunghje i primi geni di destinazione per fà a reazzione PCR.

Siconda, a tecnulugia di PCR diretta ùn hè micca solu una tecnulugia di amplificazione di mudelli di DNA tradiziunale, ma include ancu PCR di trascrizione inversa di u mudellu di RNA.

Terzu, Tecnulugia PCR Direct ùn solu eseguisce direttamente riazzioni PCR qualitative di rutina nantu à i campioni di tissuti, ma include dinù reazzioni qPCR Real-Time, chì esige u sistema di reazzione à avè una forte capacità di interferenza di fluoriscenza anti-sfondu è quenchers fluoriscenza endogenu a capacità antagonistiche.

Quartu, i campioni mirati da a tecnulugia PCR diretta solu bisognu di a liberazione di mudelli di l'acidu nucleicu, è ùn sguassate micca proteini, polisaccaridi, ioni di sali, etc. chì interferiscenu cù a reazzione PCR.Chì esige a polimerasi di l'acidu nucleicu è a PCR Mix in u sistema di reazione per avè una resistenza eccellente è adattabilità per assicurà l'attività enzimatica è a precisione di replicazione in cundizioni cumplessi.

Quintu, u campionu di tissutu destinatu à a tecnulugia PCR diretta senza trattamentu di arricchimentu di l'acidu nucleicu è a quantità di mudellu hè assai chjuca, chì esige u sistema di reazione per avè una sensibilità estremamente alta è efficienza di amplificazione.