A verificazione di u funziunamentu di i primeri è di e sonde in a prima fase di i reagenti PCR è a determinazione di e cundizioni di reazione più adattate sò i prerequisiti per assicurà u prugressu lisu di l'esperimenti formali.
Allora cumu avemu bisognu di cunfirmà a sonda di prima in a prima fase?
L'indicatori principali sò basali, curva di amplificazione, valore ct, efficienza di amplificazione, rilevazione di campioni di bassa cuncentrazione, CV, etc.
Baseline
A basa hè a linea horizontale in a curva di amplificazione PCR.In i primi ciculi di a reazione di amplificazione PCR, u signale di fluoriscenza ùn cambia assai è forma una linea recta.Questa linea recta hè a linea di basa.
Quandu u screening di sonde di primer PCR, fate attenzione à se a basa hè u nivellu.A purità di a cuncentrazione di a sonda di prima affettarà a linea di basa, cum'è a causa di l'aumentu o a caduta di a basa.A basa hè ancu un indicatore assai intuitivu.
Curva di amplificazione
Un altru indicatore intuitivu hè a forma di a curva di amplificazione.Hè megliu avè una curva in forma di S per evità l'amplificazione secundaria o altre curve di amplificazione anormali.
Valore Ct
U nùmeru di ciculi chì currispondenu à u puntu d'inflessione da a basa à a crescita esponenziale hè u valore Ct.
Per a stessa mostra, e diverse sonde di primer risultatu in diverse curve di amplificazione, è u valore Ct currispundente serà affettatu da l'efficienza di amplificazione è u gradu di interferenza.In teoria, u più chjucu u valore Ct di a sonda di prima scelta, u megliu.
Efficienza di amplificazione
Unu di i metudi più affidabili è stabili per evaluà l'efficienza di l'amplificazione di PCR hè a curva standard, chì hè ancu largamente ricunnisciuta da i circadori.U metudu implica di fà una seria di campioni per cuntrullà u numeru relative di mudelli di destinazione.Questi campioni sò generalmente fatti da diluzioni seriali di suluzioni di stock cuncentrati, u più comunmente utilizatu hè a diluzione di 10 volte.Utilizendu una seria di campioni diluiti, utilizendu u prugramma standard qPCR per amplificà per ottene u valore Cq, è infine tracciate una curva standard secondu a cuncentrazione di ogni mostra è u valore Cq currispundente per ottene l'equazioni lineari Cq = -klgX0 + b, è l'efficienza di amplificazione E = 10 (-1 / k) -1.Quandu si usa qPCR per l'analisi quantitativa, l'efficienza di l'amplificazione deve esse in a gamma di 90% -110% (3.6> k> 3.1).
Rilevazione di campioni à bassa cuncentrazione
Quandu a cuncentrazione di mostra hè bassa, i tassi di rilevazione di e diverse sonde di primer sò sfarenti.Selezziunamu 20 campioni di bassa cuncentrazione per riplicà, è u sistema di sonda di primer cù a più alta rata di rilevazione hè u megliu.
Coefficient di variazione (CV)
10 campioni duplicati ponu esse rilevati cù diverse sonde di primer secondu u standard di linea di u reattivu per a rilevazione di l'amplificazione di l'acidu nucleicu.
Reagenti quantitativi:
Accuratezza
A precisione in un batch deve esse cumpletu: u coefficient di variazione (CV,%) di u valore logaritmicu di a cuncentrazione di prova hè ≤5%.Quandu a cuncentrazione di mostra hè bassa, u coefficient di variazione (CV,%) di u logaritmu di a cuncentrazione di rilevazione hè ≤10%
Reagenti qualitativi:
Accuratezza
L'accuratezza in un batch duverebbe risponde à:
(1) Coefficient di variazione di u valore Ct (CV,%) ≤5%
A stessa mostra hè pruvata in parallelu per 10 volte, è i risultati di a prova duveranu esse cunsistenti
Tempu di pubblicazione: 18-sep-2021
