In a prima fase di u focu, per via di u rapidu sviluppu, a diagnosi rapida di i pazienti suspettati hè a chjave per a prevenzione di COVID-19.Certi reagenti di rilevazione di l'acidu nucleicu appruvati anu un cortu tempu di sviluppu, è ci sò prublemi cum'è a cunferma di u funziunamentu in fretta, ottimisazione di reagenti insufficiente, è grande differenze trà lotti;I prublemi di diversi laboratorii clinichi in diversi aspetti di u prucessu di rilevazione di l'acidu nucleicu pò ancu influenzà l'accuratezza di i risultati di rilevazione di l'acidu nucleicu.Questu articulu hà da fucalizza nantu à i ligami è i punti chjave in l'attuale rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2, è analizà i prublemi di falsi negativi è riesaminazioni pusitivi di a rilevazione di l'acidu nucleicu di laboratoriu è l'inconsistenza clinica.

Principi di rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 hè un virus RNA cù una sequenza di genoma di circa 29 kb, cù 10 geni, chì ponu codificà efficacemente 10 proteine.I virus sò cumposti da RNA è proteini, è a capa più esterna hè un revestimentu esternu cumpostu di lipidi è glicoproteini.Dentru, a capside di a proteina avvolge l'RNA in questu, prutegge cusì l'RNA facilmente degradabile (P1).

P1 Struttura di SARS-COV-2

I virus invadenu e cellule à traversu receptori specifichi di a superficia cellulare per causà infezzione, è utilizanu cellule ospiti per riplicà.

U principiu di a rilevazione di l'acidu nucleicu virali hè di espose l'RNA virali attraversu un lisatu di cellula, è dopu aduprà a reazione in catena di polimerasi di trascrizione inversa fluorescente in tempu reale (RT-PCR) per a rilevazione.

A chjave per u principiu di deteczione hè di utilizà primers è sonde per ottene una "corrispondenza mirata" di e sequenze di l'acidu nucleicu, vale à dì, per truvà a sequenza di l'acidu nucleicu di SARS-CoV-2 chì hè diversa da l'altri virus in circa 30.000 basi (a similitudine di l'acidu nucleicu à altri virus) Zona "bassa"), cuncepimentu di primers è sonde.

I primi è e sonde sò assai cuncordati cù a regione specifica di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2, vale à dì, a specificità hè assai forte.Una volta chì u risultatu di l'amplificazione RT-PCR fluorescente in tempu reale di a mostra da pruvà hè pusitiva, prova chì SARS-CoV-2 hè presente in u campione.Vede P2.

P2 Passi di determinazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente in tempu reale)

Cundizioni è esigenze di u laboratoriu per a rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2

I laboratori di teste di l'acidu nucleicu sò i più ideali per l'ambienti di pressione negativa, è devenu attentu à u monitoraghju di a pressione, mantene l'aria chì scorri, è eliminà l'aerosols.U persunale di teste di l'acidu nucleicu deve avè qualificazione currispondente, riceve una furmazione pertinenti in a reazione di a catena di polimerasi è passa a valutazione.U laboratoriu deve esse strettamente gestitu, zonatu in u locu, è u persunale irrilevante hè strettamente pruibitu di entre.A zona pulita deve esse ventilata è disinfettata in u locu.L'articuli pertinenti sò posti in zoni, puliti è sporchi sò siparati, rimpiazzati à tempu, è decontaminati in u locu.A disinfettazione di rutina: U disinfettante chì cuntene u cloru hè a suluzione principale per i spazii più grande, è l'alkohol 75% pò esse usatu per i spazii chjuchi.Una bona manera di trattà cù l'aerosols hè di apre i finestri per a ventilazione, è a disinfezione di l'aire pò ancu esse realizatu per mezu di raghji ultraviolet, filtrazione è disinfezione di l'aire.

Ligami chjave è parametri di determinazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 (RT-PCR fluorescente in tempu reale)

Ancu s'è i laboratorii generalmente prestanu assai attenzione à a "deteczione" di l'acidu nucleicu, in fattu, l'"estrazione" di l'acidu nucleicu hè ancu unu di i passi chjave per a rilevazione di successu, chì hè strettamente ligata à a cullizzioni è u almacenamentu di campioni di virus.

Attualmente, i mostri respiratorii più utilizati, cum'è i tamponi nasofaringeali, utilizanu u sicondu metudu, chì hè una suluzione di inattivazione (preservazione) preparata nantu à l'estrazione di l'acidu nucleicu è a suluzione di lisi.Da una banda, sta suluzione di preservazione di virus pò denature a proteina di u virus, perde a so attività è ùn esse più infizziosa, è migliurà a sicurità di u trasportu è u stadiu di rilevazione;da l'altra banda, pò direttamente cracke u virus per liberà l'acidu nucleicu, eliminà l'enzima di descomposizione di l'acidu nucleicu, è impedisce u virus.L'RNA hè degradatu.

Una soluzione di campionamentu di virus preparata nantu à a basa di una soluzione di lisi di estrazione di l'acidu nucleicu.I cumpunenti principali sò sali equilibrati, agenti chelanti di l'acidu etilendiamminotetraaceticu, sali di guanidina (isotiocianato di guanidina, cloridrato di guanidina, etc.), surfactant anionicu (dodecane) sulfate di sodiu), tensioattivu cationicu (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), fenol, proteina, 8-idrothiquinoline, o più altri cumpunenti di K-8-idrothiquino.Attualmente, ci sò parechji tippi di kit d'estrazione di l'acidu nucleicu, è sò usati diversi reagenti d'estrazione di l'acidu nucleicu è di purificazione.Ancu s'ellu si usa u stessu reagentu di l'estrazione di l'acidu nucleicu è di purificazione, i prucessi di estrazione di ogni kit sò diffirenti.

Attualmente, i prudutti di u kit di rilevazione di l'acidu nucleicu appruvati da l'Amministrazione Naziunale di Prodotti Medichi sò scelti nantu à i geni ORF1ab, E è N in u genoma SARS-CoV-2.I principii di rilevazione di diversi prudutti sò basamenti listessi, ma i so primers è i disinni di sonda sò diffirenti.Ci sò segmenti unicu target (ORF1ab), segmenti dual-target (ORF1ab, N o E) è segmenti à trè target (ORF1ab, N è E).A diferenza trà a rilevazione è l'interpretazione, l'estrazione di l'acidu nucleicu è u sistema di reazione fluorescente RT-PCR in tempu reale deve riferite à l'istruzzioni di kit pertinenti, è hè cunsigliatu chì l'utilizatori seguitanu strettamente u metudu di interpretazione specificatu in l'istruzzioni di u kit per l'interpretazione.E regioni cumuni, primers è sequenze di sonda amplificate da RT-PCR fluorescente in tempu reale sò mostrati in P3.

P3 U locu di u target di l'amplicone SARS-CoV-2 nantu à u genoma è a sequenza di primers è sonde

Interpretazione di i risultati di a determinazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 (Rmanghja-TRT-PCR fluorescente ime)

"Piano di Prevenzione è Controlu di Pneumonia per l'Infezzione SARS-CoV-2 (Seconda Edizione)" per a prima volta hà clarificatu i criteri per ghjudicà i risultati di l'amplificazione di un genu unicu:

1. No Ct o Ct≥40 hè negativu;

2. Ct <37 hè pusitivu;

3. U valore Ct di 37-40 hè a zona di scala grisa.Hè cunsigliatu di ripetiri l'esperimentu.Se u risultatu di rifarà Ct <40 è a curva di amplificazione hà picchi evidenti, u campione hè ghjudicatu cum'è pusitivu, altrimenti hè negativu ".

A terza edizione di a guida è a quarta edizione di a guida cuntinuavanu i criteri di sopra.Tuttavia, per via di i diversi obiettivi utilizati in i kits cummirciali, a 3ª edizione di a guida sopra citata ùn hà micca datu i criteri per a determinazione di a cumminazione di obiettivi, enfatizendu L'istruzzioni furnite da u fabricatore prevaleranu.Partendu da a quinta edizione di e linee guida, sò stati clarificati dui obiettivi, in particulare i criterii di ghjudiziu per un scopu unicu chì hè difficiule di ghjudicà.Vale à dì, se u laboratoriu vole cunfirmà chì un casu hè pusitivu per a rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2, i seguenti deve esse cumpletu 1 di 2 cundizioni:

(1) Dui obiettivi di SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) in u stessu campione sò testati pusitivi da RT-PCR fluorescente in tempu reale.Se un unicu mira hè pusitivu, sò necessarii ri-sampling è re-test.Se i risultati di a prova sò Se u scopu unicu hè sempre pusitivu, hè ghjudicatu cum'è pusitivu.

(2) Dui campioni di RT-PCR fluorescenti in tempu reale anu mostratu un unicu target pusitivu à u stessu tempu o dui campioni di u listessu tipu anu mostratu un unicu risultatu di test di destinazione, chì pò esse ghjudicatu cum'è pusitivu.Tuttavia, e linee guida sottolineanu ancu chì i risultati negativi di e teste di l'acidu nucleicu ùn ponu micca escludiri l'infezione SARS-CoV-2.Fattori chì ponu causà falsi negativi deve esse escluditi, cumpresa a qualità di mostra povera (mostri respiratorii da l'orofaringe è altre parti), a raccolta di campioni troppu prestu o troppu tardi, I campioni ùn sò micca stati almacenati, trasportati è processati currettamente, è a tecnulugia stessa hà avutu prublemi (variazione di virus, inhibizione PCR), etc.

Cause di falsi negativi in ​​a rilevazione di SARS-CoV-2

U cuncettu di "falsi negativu" in a prova di l'acidu nucleicu chì hè attualmente interessatu, spessu si riferisce à "falsi negativi" in quale i risultati di a prova di l'acidu nucleicu sò inconsistenti cù manifestazioni cliniche, vale à dì, i sintomi clinichi è i risultati di l'imaghjini sò assai suspettati di COVID-19, ma i testi di l'acidu nucleicu sò sempre "negativi" parechje volte.U Centru di Laboratoriu Clinicu di a Cummissione Naziunale di Salute hà spiegatu u test SARS-CoV-2 "falsu negativu".

(1) Ci hè una certa quantità di virus in e cellule di a persona infettata.I dati esistenti mostranu chì dopu chì u corpu hè infettatu da u virus, u virus entra in a gola per u nasu è a bocca, dopu à a trachea è i bronchi, è poi righjunghji l'alveoli.A persona infettata hà da sperienze u periodu d'incubazione, sintomi ligeri, è dopu u prucessu di sintomi severi, è e diverse tappe di a malatia.È a quantità di virus presente in diverse parti di u corpu hè diversu.

In quantu à a carica virali di i tipi di cellule, cellule epiteliali alveolari (via respiratoria inferiore)> cellule epiteliali di e vie aeree (via respiratorie superiore)> fibroblasti, cellule endoteliali è macrophages, etc.;da u tipu di mostra, u fluidu di lavaggio alveolar (u più Eccellente)> sputum di tosse profonda> swab nasofaringeal> swab oropharyngeal> sangue.Inoltre, u virus pò ancu esse rilevatu in feces.Tuttavia, cunsiderendu a cunvenzione di l'operazione è l'accettazione di i pazienti, l'ordine di mostra clinica cumunimenti utilizatu hè u tampone orofaringeo> swab nasofaringeo> fluidu di lavaggio bronchiale (operazione cumplessa) è sputum prufonda (di solitu tosse secca, difficiuli d'ottene).

Per quessa, a quantità di virus in e cellule di l'orofaringe o nasofaringe di certi pazienti hè chjuca o estremamente bassu.Se solu i mostri di l'orofaringe o di a nasofaringe sò pigliati per a prova, l'acidu nucleicu virali ùn serà micca rilevatu.

(2) Nisuna cellula chì cuntene virus hè stata cullata durante a raccolta di campioni, o l'acidu nucleicu virali ùn hè statu cunservatu in modu efficace.

[① U situ di cullizzioni impropriu, per esempiu, quandu si cullighjanu tamponi orofaringeali, a prufundità di cullizzioni ùn hè micca abbastanza, i swabs nasofaringeali cullati ùn sò micca cullati in a cavità nasale, etc. A maiò parte di e cellule cullate pò esse cellule senza virus;

②I tamponi di campionamentu sò usati incorrectamente.Per esempiu, fibre sintetiche cum'è fibra PE, fibra di poliester è fibra di polipropilene sò cunsigliate per u materiale di a testa di swab.Fibre naturali, cum'è u cuttuni, sò aduprate in u funziunamentu attuale (adsorption forte di prutezione è micca faciule da lavà) E fibre di nylon (absorzione d'acqua povera, chì porta à un voluminu di campionamentu insufficiente);

③Usu sbagliatu di tubi di almacenamentu di virus, cum'è l'abusu di tubi di almacenamentu di polipropilene o di plastica di polietilene chì sò faciuli d'assorbire l'acidi nucleici (DNA / RNA), risultatu in una diminuzione di a cuncentrazione di l'acidu nucleicu in a suluzione di almacenamiento.In a pratica, hè ricumandatu à utilizà u polietilene-propilene polimeru plasticu è certi cuntenituri di plastica di polipropilene trattatu apposta per almacenà l'acidi nucleici virali.]

[① U situ di cullizzioni impropriu, per esempiu, quandu si cullighjanu tamponi orofaringeali, a prufundità di cullizzioni ùn hè micca abbastanza, i swabs nasofaringeali cullati ùn sò micca cullati in a cavità nasale, etc. A maiò parte di e cellule cullate pò esse cellule senza virus;

②I tamponi di campionamentu sò usati incorrectamente.Per esempiu, fibre sintetiche cum'è fibra PE, fibra di poliester è fibra di polipropilene sò cunsigliate per u materiale di a testa di swab.Fibre naturali, cum'è u cuttuni, sò aduprate in u funziunamentu attuale (adsorption forte di prutezione è micca faciule da lavà) E fibre di nylon (absorzione d'acqua povera, chì porta à un voluminu di campionamentu insufficiente);

③Usu sbagliatu di tubi di almacenamentu di virus, cum'è l'abusu di tubi di almacenamentu di polipropilene o di plastica di polietilene chì sò faciuli d'assorbire l'acidi nucleici (DNA / RNA), risultatu in una diminuzione di a cuncentrazione di l'acidu nucleicu in a suluzione di almacenamiento.In a pratica, hè ricumandatu à utilizà u polietilene-propilene polimeru plasticu è certi cuntenituri di plastica di polipropilene trattatu apposta per almacenà l'acidi nucleici virali.]

(4) L'operazione di u laboratoriu clinicu ùn hè micca standardizatu.Cundizioni di trasportu è almacenamentu di campioni, funziunamentu standardizatu di laboratori clinichi, interpretazione di risultati è cuntrollu di qualità sò i fatturi chjave per assicurà l'accuratezza è l'affidabilità di i risultati di teste.Sicondu i risultati di a valutazione di qualità esterna realizata da u Centru di Laboratoriu Clinicu di a Cummissione Naziunale di Salute u 16-24 di marzu di u 2020, di i 844 laboratorii chì anu ricevutu risultati validi, 701 (83,1%) eranu qualificati, è 143 (16,9%) ùn eranu micca.Qualificatu, e cundizioni generali di teste di u laboratoriu sò boni, ma i diversi laboratorii anu sempre differenze in a capacità di funziunamentu di u persunale, a capacità d'interpretazione di campioni pusitivi in ​​una sola destinazione è u cuntrollu di qualità.

Cumu riduce u falsu negativu di a rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2?

A riduzzione di falsi negativi in ​​a deteczione di l'acidu nucleicu deve esse ottimizzata da i quattru aspetti di pruduce falsi negativi.

(1) Ci hè una certa quantità di virus in e cellule di a persona infettata.A cuncentrazione di u virus in diverse parti di u corpu di e persone suspettate infettate serà sfarente in tempi diversi.Se ùn ci hè micca a faringe, pò esse in u fluidu di lavage bronchiale o feces.Se parechji tippi di mostri ponu esse raccolti à u stessu tempu o in diverse tappe di progressione di a malatia per a prova, Aiuterà à evità falsi negativi.

(2) E cellule chì cuntenenu virus devenu esse raccolte durante a raccolta di campioni.Stu prublema pò esse risolta in gran parte rinforzendu a furmazione di i cullettori di mostra.

(3) Reagenti IVD affidabili.Facendu ricerche nantu à a valutazione di u rendiment di rilevazione di reagenti à u livellu naziunale, è discutendu i prublemi esistenti, l'efficienza di rilevazione di i reagenti pò esse migliurata è a sensibilità di l'analisi pò esse migliurata.

(4) Funzionamentu standardizatu di laboratori clinichi.Per rinfurzà a furmazione di u persunale di u laboratoriu, migliurà continuamente u sistema di gestione di a qualità di u laboratoriu, assicurendu divisioni ragiunate, è migliurà a capacità di u persunale di detectà, hè pussibule di riduce falsi negativi per via di operazioni di laboratori improprie.

Motivi per a riprovazione positiva di a prova di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 in pazienti recuperati è liberati

U "Piano di Diagnosi è Trattamentu di COVID-19 (Trial Seventh Edition)" stipula chjaramente chì unu di i criterii per i pazienti COVID-19 per esse guariti è liberati da l'uspidale hè chì duie mostre consecutive di e vie respiratorie anu una prova di l'acidu nucleicu negativu (almenu 24 ore di distanza), ma ci sò assai pochi.

(1) SARS-CoV-2 hè un novu virus.Hè necessariu di capisce più u so mecanismu patogenicu, a stampa completa di a malatia causata è e caratteristiche di u cursu di a malatia.Per quessa, da una banda, hè necessariu di rinfurzà a gestione di i malati liberati è di fà l'osservazione medica di 14 ghjorni.Eseguite u seguimentu, u monitoraghju di a salute è a guida di salute per approfondisce a cunniscenza di tuttu u prucessu di l'occurrence, u sviluppu è u risultatu di a malatia.

(2) U paziente pò esse infettatu di novu cù u virus.L'accademicu Zhong Nanshan hà dettu: Perchè i pazienti guariti anu anticorpi, SARS-CoV-2 pò esse eliminatu da l'anticorpi quandu invadenu di novu.Ci hè parechje mutivi, chì ponu esse a causa di u paziente recuperatu, o pò esse ligata à a mutazione di u virus, o ancu a causa di teste di laboratori.S'ellu hè u virus stessu, a mutazione SARS-CoV-2 pò causà l'anticorpu pruduttu da u paziente recuperatu per esse inefficace contr'à u virus mutatu.Se u paci hè infettatu novu cù u virus mutatu, a prova di l'acidu nucleicu pò esse di novu pusitivu.

(3) In quantu à i metudi di teste di laboratoriu, ogni metudu di prova hà e so limitazioni.A rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 hè dovuta à l'scelta di a sequenza di geni, a cumpusizioni di reagenti, a sensibilità di u metudu è altri motivi, chì portanu à i kit esistenti anu i so limiti di rilevazione più bassi.Dopu chì u paci hè trattatu, u virus in u corpu diminuite.Quandu a carica virali in a mostra per esse pruvata hè sottu à u limitu minimu di deteczione, un risultatu "negativu" appariscerà.Tuttavia, stu risultatu ùn significa micca chì u virus in u corpu hè completamente sparitu.U virus pò esse dopu chì u trattamentu hè firmatu.Resurrezzione ", cuntinuà à copià.Per quessa, hè cunsigliatu di rivisione una volta à settimana in 2 à 4 simane dopu a scaricamentu.

(4) L'acidu nucleicu hè u materiale geneticu di u virus.U virus hè uccisu dopu chì u paci hè sottumessu à trattamentu antivirale, ma i frammenti di RNA virali rimanenti sò sempre ritenuti in u corpu umanu, è ùn sò micca liberati completamente da u corpu.Calchì volta, in certi circustanzi, pò esse più conservatu.Un longu tempu, è in questu tempu a prova di l'acidu nucleicu serà "transitoria" positiva.Cù l'estensione di u tempu di ricuperazione di u paziente, dopu chì i frammenti di RNA residuali in u corpu sò gradualmente esauriti, u risultatu di a prova di l'acidu nucleicu pò turnà negativu.

(5) U risultatu di a prova di l'acidu nucleicu di SARS-CoV-2 prova solu a prisenza o l'assenza di RNA virali, è ùn pò micca pruvà l'attività di u virus è se u virus hè trasmissibile.Hè necessariu di pruvà se un paziente chì hà una prova di l'acidu nucleicu pusitivu torna torna una fonte d'infezzione.Hè necessariu di realizà a cultura di virus nantu à i campioni clinichi è cultivà un virus "vivu" per pruvà chì hè infettivu.

Riassuntu

In riassuntu, l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 teste falsi negativi, retest pusitivi, è altre cundizioni chì sò inconsistenti cù manifestazioni cliniche ùn ponu esse completamente evitati.In u screening è a prova attuale, hè cunsigliatu di cumminà sintomi clinichi, esami di imaging (CT) è esperimenti Test di laboratoriu (test d'acidu nucleicu + test di anticorpi specifichi di virus) risultati per un diagnosticu cumpletu per prevene un diagnosticu sbagliatu è un misdiagnosis.Se i risultati di a prova si trovanu ovviamente inconsistenti cù e manifestazioni cliniche, hè cunsigliatu di fà un analisi cumpletu di tuttu u ligame di prova (raccolta di campioni, circulazione è ligami di trasfurmazioni) per escludiri l'infezzione precoce di u virus SARS-CoV-2, l'infezione recurrente o cumminata cù altre infizzioni di virus respiratorii, etc.Se e cundizioni permettenu, hè cunsigliatu di cullà campioni più sensittivi, cum'è sputum o fluidu di lavu alveolar per riesame.

Prodotti Relativi:

Kit di rilevazione di l'acidu nucleicu SARS-CoV-2 (Metudu di sonda fluorescente PCR Multiplex)