Materiale di partenza: RNA

A PCR di trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) hè un metudu sperimentale utilizatu in esperimenti di PCR chì utilizanu RNA cum'è materiale di partenza.In questu metudu, l'RNA tutale o l'RNA messenger (mRNA) hè prima trascrittu in DNA cumplementariu (cDNA) da a transcriptase inversa.In seguitu, una reazione qPCR hè stata realizata utilizendu u cDNA cum'è mudellu.RT-qPCR hè stata utilizata in una varietà di applicazioni di biologia moleculare, cumprese l'analisi di l'espressione genica, a validazione di l'interferenza di RNA, a validazione di microarray, a rilevazione di patogeni, i testi genetichi è a ricerca di e malatie.

Metodi à un passu è dui passi per RT-qPCR

RT-qPCR pò esse realizatu da un metudu in un passu o dui passi.L'RT-qPCR in un passu combina a trascrizione inversa è l'amplificazione PCR, chì permette a transcriptase inversa è l'ADN polimerasi per cumpletà a reazione in u stessu tubu in e stesse cundizioni di buffer.L'RT-qPCR in un passu richiede solu l'usu di primers specifichi di sequenza.In RT-qPCR in dui tappe, a trascrizione inversa è l'amplificazione PCR sò realizate in dui tubi, utilizendu diversi buffer ottimizzati, cundizioni di reazione è strategie di cuncepimentu di primer.

I prudutti cunnessi:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Un Passu)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Un passu)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix per a sintesi CDNA di u primu filu

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Selezzione di RNA totale è mRNA

Quandu si cuncepisce un esperimentu RT-qPCR, hè impurtante decide di utilizà RNA tutale o mRNA purificatu cum'è mudellu per a trascrizione inversa.Ancu s'ellu mRNA pò esse capaci di furnisce una sensibilità ligeramente più altu, l'RNA tutale hè sempre spessu usatu.U mutivu di questu hè chì l'RNA tutale hà un vantaghju più impurtante cum'è materiale di partenza chì mRNA.Prima, u prucessu richiede menu passi di purificazione, chì assicura una megliu ricuperazione quantitativa di u mudellu è una megliu normalizazione di i risultati à i numeri di cellule di partenza.Siconda, evita u passu di arricchimentu di mRNA, chì pò evità a pussibilità di risultati distorti per via di e diverse ricuperazioni di diversi mRNA.In generale, postu chì in a maiò parte di l'applicazioni a quantificazione relativa di u genu di destinazione hè più impurtante chè a sensibilità assoluta di a deteczione, l'RNA tutale hè più adattatu in a maiò parte di i casi.

Primer di trascrizione inversa

In u metudu di dui passi, trè metudi diffirenti ponu esse utilizati per prima a reazione di cDNA: primers oligo (dT), primers aleatoriu, o primers specifichi di sequenza.Di genere, oligo (dT) primers è primers aleatori sò usati in cumminazione.Questi primers anneanu à u filu di mRNA di u mudellu è furnisce a transcriptase inversa cun un puntu di partenza per a sintesi.

Trascrittasi inversa

A transcriptase inversa hè una enzima chì usa RNA per sintetizà DNA.Alcune transcriptasi inverse anu attività di RNase è ponu degradare i filamenti di RNA in filamenti hibridi RNA-DNA dopu a trascrizione.Se ùn hà micca attività enzimatica RNase, RNaseH pò esse aghjuntu per una più alta efficienza qPCR.L'enzimi cumunimenti usati includenu a transcriptase inversa di u virus di leucemia murina Moloney è a transcriptase inversa di u virus mieloblastoma aviari.Per RT-qPCR, hè ideale per sceglie una transcriptase inversa cù una termostabilità più alta, perchè a sintesi di cDNA pò esse realizata à temperature più elevate, assicurendu una trascrizzione riescita di RNAs cù una struttura secundaria più alta, mantenendu a so attività completa in tutta a reazione, risultatu in un rendimentu di cDNA più altu.

I prudutti cunnessi:

Trascrittasi inversa di Foreasy M-MLV

Attività RNase H di trascrittasi inversa

RNaseH hè capaci di degradare i filamenti di RNA da i duplexi RNA-DNA, permettendu una sintesi efficiente di DNA a doppia catena.In ogni casu, quandu si usa l'ARNm longu cum'è mudellu, l'ARN pò esse degradatu prematuramente, risultatu in un ADNc truncatu.Per quessa, hè spessu benefiziu per minimizzà l'attività di RNaseH durante a clonazione di cDNA se a sintesi di trascrizioni longu hè desiderata.In cuntrastu, i transcriptasi inversi cù l'attività RNase H sò spessu benefizii per l'applicazioni qPCR perchè aumentanu a fusione di duplex RNA-DNA durante u primu ciclu di PCR.

Disegnu di prima

I primers di PCR usati per u passu qPCR in RT-qPCR sò idealmente pensati per abbracciare una giunzione esone-esone, induve un primer di amplificazione puderia potenzialmente span un cunfine esone-introne attuale.Siccomu e sequenze di DNA genomicu chì cuntenenu introni ùn sò micca amplificate, stu disignu reduce u risicu di falsi pusitivi amplificati da a contaminazione di DNA genomicu.

Se i primers ùn ponu micca esse designati per separà esoni o frontiere esone-esone, pò esse necessariu di trattà campioni di RNA cù DNase I o dsDNase senza RNasi per sguassà a contaminazione di DNA genomicu.

cuntrollu RT-qPCR

Un cuntrollu negativu di trascrizione inversa (controllo -RT) deve esse inclusu in tutti l'esperimenti RT-qPCR per detectà a contaminazione di l'ADN (cum'è DNA genomicu o prudutti di PCR da reazzione precedente).Stu cuntrollu cuntene tutti i cumpunenti di reazzione eccettu a transcriptase inversa.Siccomu a trascrizione inversa ùn si trova micca cù questu cuntrollu, se l'amplificazione di PCR hè osservata, a contaminazione da DNA hè più prubabile.