Diversi invenzioni rivoluzionarie in a storia di a tecnulugia di deteczione in a mo mente sò a tecnulugia di immunomarcazione basata nantu à u principiu di u ligame specificu di l'antigenu-anticorpu, a tecnulugia PCR è a tecnulugia di sequenza.Oghje parlemu di a tecnulugia PCR.Sicondu l'evoluzione di a tecnulugia PCR, a ghjente divide abitualmente a tecnulugia PCR in trè generazioni: tecnulugia PCR ordinaria, tecnulugia PCR quantitativa fluorescente in tempu reale è tecnulugia PCR digitale.
Ctecnica comune di PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis hà inventatu a reazzione di a catena di polimerasi (reazione di a catena di polimerasi, PCR) in u 1983. Si dice chì quandu guidava a so fidanzata, di colpu hà avutu un lampu d'ispirazione è pensa à u principiu di a PCR (nantu à i benefici di a guida).Kary Mullis hè stata premiata u Premiu Nobel in Chimica in 1993. U New York Times hà cummentatu: "Altamente originale è significativu, quasi dividendu a biologia in epoche pre-PCR è post-PCR.
U principiu di a PCR: Sutta a catalisi di l'ADN polimerasi, l'ADN di filamentu madre hè utilizatu cum'è mudellu, è u primer specificu hè utilizatu cum'è u puntu di partenza di l'estensione, è l'ADN di filamentu figliu cumplementarii à u DNA di filamentu madre hè copiatu in vitro per denaturazione, annealing, estensione è altri passi.Hè una tecnulugia di amplificazione di sintesi di DNA in vitro, chì pò amplificà rapidamente è specificamente qualsiasi DNA target in vitro.
Vantaghji di PCR ordinariu
1.Metudu classicu, cumpletu standard internaziunali è domestici
2.U costu più bassu di i reagenti di l'instrumentu
3.I prudutti di PCR ponu esse recuperati per altri esperimenti di biologia moleculare
Macchina PCR Foregene consigliata: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
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Svantaghji di PCR ordinariu
1.facile à inquinare
2.operazione ingombrante
3.solu analisi qualitativa
4.Sensibilità moderata
5.Ci hè una amplificazione non specifica, è quandu a banda non specifica hè a stessa dimensione di a banda di destinazione, ùn pò micca esse distinta.
CPCR basata nantu à l'elettroforesi apillare
In risposta à i difetti di PCR ordinariu, certi pruduttori anu introduttu strumenti basati nantu à u principiu di l'elettroforesi capillare.U passu di l'elettroforesi dopu l'amplificazione PCR hè cumpletu in u capillare.A sensibilità hè più altu, è a diferenza di parechje basi pò esse distinta è l'amplificazione pò esse calculata da MAERKER.cuntenutu di u produttu.U svantaghju hè chì u pruduttu PCR deve esse sempre apertu è mette in l'instrumentu, è ci hè sempre un grande risicu di contaminazione.
CapillaireEl'elettroforesi
2. Tecnulugia PCR quantitativa fluorescente in tempu reale (PCR Quantitative Real-time, qPCR)A PCR quantitativa fluoriscente, ancu chjamata PCR in Real-Time, hè una nova tecnulugia quantitativa di l'acidu nucleicu sviluppata da PE (Perkin Elmer) in 1995. A storia di u sviluppu di a PCR quantitativa fluorescente hè una storia di lotte animate di giganti cum'è ABI, Roche è Bio-Rad.Sè site interessatu, pudete verificà fora.Sta tecnica hè attualmente a tecnica di PCR semi-quantitativa più matura è largamente usata.
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Metodu di tintura fluorescente (SYBR Green I):SYBR Green I hè u colorante di legame à l'ADN più cumunimenti utilizatu per a PCR quantitativa, chì si lega micca specificamente à l'ADN doppia filamentu.In u statu liberu, SYBR Green emette una debule fluoriscenza, ma una volta ligata à l'ADN à doppia catena, a so fluoriscenza aumenta di 1000 volte.Per quessa, u signale fluorescente tutale emessu da una reazione hè proporzionale à a quantità di DNA à doppia catena presente è aumenterà cù l'aumentu di u pruduttu amplificatu.Siccomu u colorante si lega micca specificamente à l'ADN à doppia catena, i risultati falsi pusitivi ponu esse generati.
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Metudu sonda fluorescente (tecnologia Taqman): DuranteAmplificazione PCR, una sonda fluorescente specifica hè aghjuntu à u stessu tempu cum'è un paru di primers.A sonda hè un oligonucleotide lineare, cù un gruppu di reporter fluorescente è un gruppu di quencher fluorescente marcati rispettivamente à e duie estremità.Quandu a sonda hè intacta, u signale fluoriscente emessu da u gruppu di reporter hè assorbutu da u gruppu quencher, è a rilevazione Ùn ci hè micca signale fluoriscente;durante l'amplificazione PCR (in a fase di estensione), l'attività 5'-3' Dicer di l'enzima Taq digerirà è degradarà a sonda, in modu chì u gruppu fluorescente reporter è u gruppu fluorescente quencher sò separati, in modu chì u sistema di monitoraghju di fluorescenza U signale fluorescente pò esse ricevutu, vale à dì, ogni volta chì una catena di DNA hè amplificata, una molecula fluorescente hè a sincronia cumpleta di a fluorescenza. s è a furmazione di prudutti PCR.U metudu di sonda Taqman hè u metudu di rilevazione più cumunimenti utilizatu in a rilevazione clinica.
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Vantaghji di qPCR
1.U metudu hè maturu è l'equipaggiu di supportu è i reagenti sò cumpleti
2.Costu mediu di reagenti
3.faciule d'utilizà
4.Alta sensibilità è specificità di rilevazione
I svantaghji di qPCR
A mutazione di u genu di destinazione porta à a rilevazione mancata.
U risultatu di deteczione di u mudellu di bassa cuncentrazione ùn pò esse determinatu.
Ci hè un grande errore quandu si usa a curva standard per a rilevazione quantitativa.
3. Tecnulugia PCR digitale (PCR digitale, dPCR).
A PCR digitale hè una tecnica per a quantificazione assoluta di molécule d'acidu nucleicu.Comparatu cù qPCR, a PCR digitale pò leghje direttamente u numeru di molécule di DNA / RNA, chì hè a quantificazione assoluta di molécule d'acidu nucleicu in a mostra di partenza.In u 1999, Bert Vogelstein è Kenneth W. Kin-zler prupostu formalmenti u cuncettu di dPCR.
In u 2006, Fluidigm hè statu u primu à pruduce un strumentu dPCR cummerciale basatu in chip.In 2009, Life Technologies hà lanciatu i sistemi OpenArray è QuantStudio 12K Flex dPCR.In 2013, Life Technologies hà lanciatu u sistema QuantStudio 3DdPCR, chì usa a tecnulugia di chip microfluidic nano-densità di alta densità per distribuisce uniformemente campioni à 20 000 cellule individuali.in a reazione bè.
In u 2011, Bio-Rad hà lanciatu u strumentu QX100 dPCR basatu in gocce, chì usa a tecnulugia d'acqua in oliu per distribuisce uniformemente a mostra à 20 000 gocce d'acqua in oliu, è usa un analizzatore di gocce per analizà e gocce.In u 2012, RainDance hà lanciatu u strumentu RainDrop dPCR, guidatu da u gasu d'alta pressione, per dividisce ogni sistema di reazione standard in una emulsione di reazione chì cuntene da 1 à 10 milioni di micro-goccioline di picoliter.
Finu a ora, a PCR digitale hà furmatu duie fazioni maiò, u tipu di chip è u tipu di goccia.Qualunque sia u tipu di PCR digitale, i so principii core sò limitazione di diluzione, PCR endpoint è distribuzione di Poisson.U sistema di reazzione PCR standard chì cuntene mudelli di l'acidu nucleicu hè divisu uniformemente in decine di millaie di reazzioni PCR, chì sò distribuiti à chips o microdroplets, in modu chì ogni reazione cuntene quant'è pussibule una molecula di mudellu, è una reazzione di PCR di una sola molécula hè realizata.Leghjendu a fluoriscenza A prisenza o l'absenza di u signale hè cuntatu, è a quantificazione assoluta hè realizata dopu a calibrazione di a distribuzione statistica di Poisson.
E seguenti sò e caratteristiche di parechje piattaforme PCR digitale chì aghju utilizatu:
1. Bio-Rad QX200 droplet PCR digitale Bio-RadQX200 hè una piattaforma PCR digitale assai classica, u prucessu di rilevazione di basa: 20.000 campioni sò generati da u generatore di gocce. Micro-goccioline d'acqua in oliu sò amplificate nantu à una macchina PCR ordinaria, è infine u signale di fluorescenza di ogni micro-goccia hè lettu da un lettore di micro-goccia.L'operazione hè più cumplicata, è u risicu di contaminazione hè mediu.
Xinyi TD1 PCR digitale micro-gocciaXinyi TD1 hè una piattaforma PCR digitale domestica, u prucessu di deteczione di basa: generà 30.000-50.000 gocce d'acqua in oliu attraversu un generatore di gocce, amplificate nantu à un strumentu PCR cumuni, è infine passà U lettore di gocce leghje u signale fluoriscente di ogni goccia.Sia a generazione di gocce è a lettura in questa piattaforma sò realizati in un chip dedicatu cù pocu risicu di contaminazione.
STILLA Naica micro-goutte chip digitale PCRSTILLA Naica hè una piattaforma PCR digitale relativamente nova.U prucessu di deteczione di basa hè: aghjunghje a suluzione di reazione à u chip, mette u chip in u sistema di generazione è amplificazione di micro-goccia, è generà 30.000 micro-goccioline.Spread nantu à u chip, è l'amplificazione PCR hè cumpleta nantu à u chip.Allora u chip amplificatu hè trasferitu à u sistema di analisi di lettura di micro-goccia, è u signale fluorescente hè lettu da piglià ritratti.Siccomu tuttu u prucessu si svolge in un chip chjusu, u risicu di contaminazione hè bassu.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip digitale PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D hè un'altra piattaforma PCR digitale classica basata in chip.U so prucessu di deteczione di basa hè: aghjunghje a suluzione di reazzione in u spreader, è sparghje a suluzione di reazione uniformemente nantu à u chip cù 20 000 microwells attraversu u spreader., mette u chip in a macchina PCR per amplificà, è infine mette u chip in u lettore è pigliate una foto per leghje u signale fluoriscente.L'operazione hè relativamente cumplicata, è tuttu u prucessu hè realizatu in un chip chjusu, è u risicu di contaminazione hè bassu.
5. PCR digitale chip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity hè una piattaforma PCR digitale di chip-tip relativamente nova.U so prucessu di deteczione di basa hè: aghjunghje a suluzione di reazione in l'applicatore, è sparghje a suluzione di reazione uniformemente nantu à 10.000 tubi PCR fissati in u tubu PCR attraversu l'applicatore.Nantu à u chip microporous, a suluzione di reazzione entra in u chip per l'azzione capillare, è u tubu PCR cù u chip hè pusatu nantu à a macchina PCR per l'amplificazione, è infine u chip hè messu in u lettore per leghje u signale fluorescente pigliendu una foto.L'operazione hè più cumplicata.U risicu di contaminazione hè bassu.
I paràmetri di ogni piattaforma PCR digitale sò riassunti cum'è seguente:
L'indicatori di valutazione di a piattaforma PCR digitale sò: u numeru di unità split, u numeru di canali fluorescenti, a cumplessità di l'operazione è u risicu di contaminazione.Ma u più impurtante hè a precisione di deteczione.Una manera di valutà e plataforme di PCR digitale hè di utilizà parechje piattaforme di PCR digitale per verificà l'altri, è un altru modu hè di utilizà sustanzi standard cù valori precisi.
Vantaghji di dPCR
1.Uttenimentu di quantificazione assoluta
2.A più alta sensibilità è specificità
3.Pò detectà campioni di copia bassu
I svantaghji di dPCR1. Equipamentu caru è reagenti 2. Funzionamentu cumplicatu è longu tempu di rilevazione 3. Gamma di deteczione stretta
Attualmente, e trè generazioni di a tecnulugia PCR anu i so vantaghji è disadvantages, è ognunu hà u so propiu campi d'applicazione, è ùn hè micca una relazione chì una generazione rimpiazza l'altru.L'avanzamentu cuntinuu di a tecnulugia hà injectatu una nova vitalità in a tecnulugia PCR, chì li permette di sbloccare una direzzione di l'applicazione dopu l'altra, facendu a rilevazione di l'acidu nucleicu più cunvene è precisa.
Fonte: U duttore Yuan vi porta per a prova
Prudutti cunsigliati:
Tempu di post: 18-novembre-2022
