1. Detect l'assorbanza di suluzione RNA
L'assorbanza à 280, 320, 230 è 260 nm rapprisenta i valori di l'acidu nucleicu, u fondu (turbidità di a suluzione), a cuncentrazione di sali è a materia urganica cum'è a proteina, rispettivamente.In generale, fighjate solu à OD260 / OD280 (Ratio, R).Quandu 1.8 ~ 2.0, pensemu chì a contaminazione di a proteina o altre materia urganica in RNA pò esse tolleratu, ma deve esse nutatu chì quandu Tris hè utilizatu com'è buffer per detect l'assorbanza, u valore R pò esse più grande di 2 (in generale deve esse <2,2).Quandu R <1.8, a contaminazione di a proteina o altre materia urganica in a suluzione hè più evidenti, è u destinu di l'RNA pò esse determinatu secondu i bisogni.Quandu R> 2.2, significa chì l'RNA hè statu idrolizatu in un solu acidu nucleicu.
2.Electrophoretic pattern di RNA
In generale, u gel di denaturazione hè utilizatu per l'elettroforesi di RNA, ma s'ellu hè solu per a rilevazione di a qualità di l'RNA, u gel di denaturazione ùn hè micca necessariu, è u gel d'agarose ordinariu pò esse usatu.U scopu di l'elettroforesi hè di detect l'integrità di e bande 28S è 18S è u so rapportu, o l'integrità di smear mRNA.In generale, se i bandi 28S è 18S sò brillanti, chjari è sharp (riferendu à i bordi di e bande sò chjaru), è a luminosità di 28S hè più di duie volte quella di a banda 18S, cunsideremu chì a qualità di l'RNA hè bona.
I sopra sò i dui metudi chì avemu usatu cumunimenti, ma nè di sti dui metudi ponu chjaramente dici s'ellu ci hè RNase residuale in a suluzione RNA.Se ci hè una piccula quantità di RNase in a suluzione, hè difficiule per noi di detectà cù u metudu sopra, ma a maiò parte di e reazzioni enzimatici successivi sò realizati sopra à 37 gradi è per un bellu pezzu.In questu modu, s'ellu ci hè una piccula quantità di RNase in a suluzione RNA, allora ci sarà un ambiente assai adattatu è u tempu per ghjucà u so rolu in l'esperimenti successivi, è di sicuru l'esperimentu serà friddu à questu tempu.Quì sottu introducemu un metudu chì pò cunfirmà s'ellu ci hè RNase residuale in a suluzione di RNA.
3. Test di preservazione di u calore
Sicondu a cuncentrazione di mostra, tirate dui 1000 ng RNA da a suluzione di RNA è aghjunghje à un tubu di centrifuga di 0,5 ml, è cumplementà cù tampone di pH 7,0 Tris à un volume tutale di 10 ul, è poi sigilla u capu di u tubu.Mettite unu d'elli in un bagnu d'acqua di temperatura constante à 70 ° C è mantene u caldu per 1 h.L'altra parte hè stata guardata in un frigorifero -20 ° C per 1 h.Quandu u tempu hè finitu, sguassate i dui campioni per l'elettroforesi.Dopu chì l'elettroforesi hè finita, paragunate e bande elettroforetiche di i dui.Sì i bandi di i dui sò cunsistenti o ùn anu micca una diferenza significativa (di sicuru, i so bandi cumpunenu ancu e cundizioni in u metudu 2), significa chì ùn ci hè micca una contaminazione RNase residuale in a suluzione RNA, è a qualità di l'RNA hè assai bona.À u cuntrariu, se a mostra incubata à 70 ° C mostra una degradazione evidenti, indica chì ci hè una contaminazione da RNase in a suluzione di RNA.
2 Metodi è tecniche sperimentali per l'estrazione di RNA
I prublemi chì spessu scontru in l'estrazione di RNA sò: (1) u rendiment di RNA hè bassu;(2) L'RNA hà una contaminazione salina seria;(3) RNA hà una seria contaminazione di solventi organici;(4) degradazione di mostra è altri prublemi
1. Reagents d'estrazione di RNA totali cumunimenti usati
U metudu di guanidine isothiocyanate è u metudu Trizol sò i metudi più cumunimenti utilizati per l'estrazione di l'RNA tutale da i tessuti animali è e cellule animali.Hè soprattuttu adattatu per i picculi mostri è tessuti chì sò particularmente difficiuli di estrazione, cum'è l'estrazione di RNA tutale da a pelle di cunigliu è u tissutu cunghjuntivu animali;Inoltre, Trizol, cum'è un reattivu di lisi generale, pò ancu esse usatu per l'estrazione di tessuti vegetali, batteri, fungi è altri tessuti.Per i tessuti vegetali chì cuntenenu polisaccaridi è polifenoli, cum'è Camellia oleifera, foglie di tè, colza, etc., u metudu CTAB pò ancu esse usatu per estrarre l'RNA tutale.
Cum'è un metudu convenzionale, u metudu di doppia colonna hè ancu assai populari per via di u so funziunamentu di a temperatura normale, ùn hè micca bisognu di aghjunghje RNase, è a sicurità - senza cloroformu, fenoli è altri reagenti organici per l'estrazione.(prudutti cunsigliatu )
2. Estrazione di RNA tutale da i tessuti animali
(1) Prova à sceglie tissutu frescu, s'ellu ùn hè micca frescu (preferibbilmente in trè mesi - 80 ℃ frigorifique o frozen in nitrogenu lìquidu. Quandu taglià tissutu, ùn tagliate direttamente à a temperatura di l'ambienti, assicuratevi di Mettite nantu à a scatula di ghiaccio, pruvate per evitari ripetuti congelazione è scongelamento.
(2) Aduprate forbici è pinzette pulite per taglià un pezzu di tissutu, pruvate à taglià a parti cintrali di u tissutu quandu tagliate a mostra, o prima tagliate u grande pezzu di tissutu da u mezu, è dopu tagliate a mostra in a pusizione di incisione fresca.U tessulu sguassatu deve esse sbuchjatu cumplettamente, mette u tissutu shredded in un tubu EP senza RNase, aghjunghje u lysate, u tissu shredded deve esse espunutu sanu à u lysate, è preparate per l'homogeneizazione.
(3) Per i tissuti nurmali, selezziunate tissuti di fagioli mungi (30-60 mg) per l'homogeneizazione.Se i tissuti cuntenenu una grande quantità di proteina, grassu, o tessuti fibru densi cum'è u fegatu, aumentà o diminuite in modu adattatu a quantità di tissuti tagliati (opcional) Sceglite 10 ~ 20 mg).
(4) Se u musculu di pisci, carne di gamberetti, meduse è altri tissuti cù un altu cuntenutu di acqua sò estratti, u voluminu di l'esemplariu deve esse aumentatu in modu adattatu (cunsigliatu 100-200 mg).
(5) Se e cundizioni permettenu, u tissutu di l'animali pò esse direttamente estratti dopu esse homogeneizatu cù un homogeneizatore di tissuti d'altu passaghju, s'ellu ùn ci hè micca un tali equipamentu.
(6) L'RNA ottenutu dopu l'estrazione finali deve esse postu nantu à a scatula di ghiaccio immediatamente per riduce a degradazione di l'RNA.
3. Estrazione di RNA di cellula animale
(1) Cellule di sospensione: centrifugate direttamente è scartate u mediu, lavate cù PBS sterile per 1-2 volte, poi suspende cù una quantità approprita di PBS, è aghjunghje lisatu per a lisi.Ùn aghjunghje micca u lysate direttamente à e cellule precipitate dopu avè discartu cumplettamente u liquidu.Questu pruvucarà u pacchettu d'histone liberatu dopu à e cellule lisate nantu à a capa esterna per aderisce à l'esternu di e cellule precipitate, limitendu cusì u cuntattu di e cellule in u pellet cù u lysate., risultatu in una lisi cellulare incompleta è un rendimentu di RNA ridutta.
(2) Cellule chì sò semi-aderenti o micca strettamente aderenti: Dopu avè scartatu u mediu, lavate cù PBS per 1-2 volte, poi assorbe direttamente una quantità approprita di PBS è soffia u piattu di cultura cù una pipetta o una pistola per scaccià e cellule, è trasfiriu à e cellule senza RNA.Aghjunghjite u lisatu à u tubu EP di l'enzima per l'estrazione.
(3) Cellule aderenti: prima deve esse digerite cù tripsina, poi raccolte in tubi EP senza RNasi, centrifugate per caccià u supernatante, lavate 1-2 volte cù PBS per caccià l'excedente di tripsina, è risuspendendu cù una quantità adatta di PBS.
4. Estrazione di RNA di a pianta
I tessuti vegetali sò ricchi di cumposti fenolici, o ricchi di polysaccharides, o cuntenenu qualchi metabolites secundariu micca identificatu, o anu alta attività di RNase.Queste sustanzi sò strettamente cumminati cù RNA dopu a lisi di cellula per furmà cumplessi insolubili o precipitati coloidali, chì sò difficiuli di sguassà.Per quessa, quandu avemu extracte u tessulu vegetale, avemu bisognu di sceglie un kit per e piante.U lisatu in u kit pò risolve efficacemente i prublemi di l'ossidazione faciule di i polifenoli è a separazione di composti di polisaccaridi è l'acidi nucleici.
(Per l'estrazione di RNA di pianta di polisaccaridi polifenoli, prudutti cunsigliati:
(1) A buccia, a polpa, e sementi, e foglie, etc. di a pianta deve esse sanu sanu in un mortaru.Durante u prucessu di macinazione, u nitrogenu liquidu deve esse rimbursatu in u tempu per evità di funnu a mostra.A mostra di terra deve esse aghjuntu rapidamente à u lisatu è scuzzulate per evità a degradazione di l'RNA.
(2) Per i campioni ricchi di fibre, cum'è u risu è e foglie di granu, a quantità di l'estrazione deve esse ridutta in modu adattatu, altrimenti a macinazione di u tissutu è a lisi ùn saranu micca cumpleti, risultatu in un bassu rendimentu di RNA estratti.
(3) Per i tessuti vegetali cù un altu cuntenutu d'acqua, cum'è u fruttu di grana, u fruttu di anguria, u fruttu di pesche, etc., a dimensione di l'esempiu deve esse aumentata in modu adattatu (100-200 mg hè opcional).
(4) Tessuti di a pianta, cum'è foglie di pianta, rizomi, frutti duri è altri materiali sò generalmente cunsigliati per aduprà nitrogenu liquidu per mortar bè l'ingredienti in un mortar, è poi procede à u passu d'estrazione.L'homogeneizatori di tissuti cunvinziunali ùn ponu micca esse efficaci in l'homogeneizazione di i tessuti vegetali, è sò generalmente micca cunsigliatu.
5. Precauzioni per l'estrazione di RNA
(1) I campioni di tissuti duveranu esse freschi quant'è pussibule per evità a congelazione è u scongelu ripetuti.
(2) U tissutu deve esse sanu sanu durante l'estrazione, è a quantità di tissutu ùn deve esse micca troppu pocu, micca troppu.
(3) Un tempu d'incubazione sufficiente deve esse datu dopu l'aghjunzione di u lisatu per lisà cumplettamente a mostra.
(4) Quandu s'utilice u metudu Trizol per l'estrazione, u principiu di assorbe u supernatant dopu a stratificazione hè "preferite inhale less than inhale more", è ùn deve micca estratti à a capa media, altrimenti pruvucarà una seria contaminazione di DNA genomicu.
(5) Quandu u lavatu, u liquidu di lavare deve infiltratu cumplettamente intornu à u muru di u tubu per assicurà un lavatu cumpletu.
(6) Per u metudu di estrazione di a colonna, in più di staccarà a colonna dopu à lavà, a colonna d'adsorption deve ancu esse postu in un bancu ultra-pulitu è soffiatu per 5-10 minuti per evaporà cumplettamente u solvente urgànicu à a secca.
(7) À l'ultima eluzione di u metudu di a colonna, dopu à aghjunghje l'acqua DEPC, deve esse incubatu per 3-5 minuti, o l'acqua DEPC deve esse riscaldata à 60 ° C in anticipu per aumentà u rendiment di l'elution.In u tradiziunale Trizol cleavage è u metudu di precipitazione isopropanol, l'RNA finali hè dissolutu in l'acqua DEPC, cusì un tempu appropritatu deve esse datu per a dissoluzione, è u fondu di u tubu di centrifuga deve esse continuamente soffiatu cù una punta di pipette.
3 THere Cause è suluzioni per a cuncentrazione di RNA bassa / qualità povira
1. U rendiment hè troppu bassu
A mostra estratta hè troppu bassu, a quantità tutale hè insufficiente, o a mostra estratta hè troppu è a lisi ùn hè micca cumpletu;u tissutu o cellule di qualità adattata deve esse usatu per l'estrazione, u pretrattamentu di a mostra deve esse fattu bè, è a lisi deve esse abbastanza.
2. Residui di genoma
Quandu l'estrazione per u metudu Trizol, quandu u supernatant hè succhiatu in a capa media dopu a stratificazione, a contaminazione seria di u genoma serà causata;Una cura extra deve esse presa quandu a stratificazione per evità di succhià in a capa media.Se u metudu di colonna hè utilizatu per l'estrazione, un kit chì cuntene DNase I pò esse sceltu per l'estrazione.L'acidu nucleicu adsorbitu nantu à a membrana hè direttamente digeritu cù DNase I, chì pò riduce assai i residui di DNA.
3. A degradazione di l'RNA
Pò esse a degradazione di u sample extracted stessu, o a degradazione causata durante u prucessu d'estrazione;quant'è pussibule, i campioni freschi deve esse usatu per l'estrazione di RNA, è i campioni raccolti deve esse guardatu in azotu liquidu o -80 ° C in u friddu in u tempu, è a congelazione ripetuta è u scongelu deve esse evitata.Cunsiglii senza RNase / DNase, tubi di centrifuga è altri materiali anu da esse usatu in u prucessu di estrazione di RNA.U prucessu di estrazzione deve esse u più veloce pussibule.L'RNA extracted deve esse postu nantu à una scatula di ghiaccio è guardatu à -80 in u tempu.Se l'RNA estratto deve esse rilevatu da l'elettroforesi di gel, l'elettroforesi deve esse realizatu immediatamente dopu l'estrazione, è u buffer di l'elettroforesi deve esse rimpiazzatu cù un novu preparatu.
4. Salitu è residui di solventi organici
I reagenti d'estrazione cuntenenu fenoli è sali di guanidina, è a suluzione di lavare cuntene etanolu.Duranti u prucessu d'estrazione, u lisatu ùn hè micca completamente assorbutu è scartatu, è a suluzione di lavà ùn hè micca secca.I sali residuali è i solventi organici sò dannosi per a trascrizzione inversa è a PCR successive.Diversi gradi di inibizione, cusì u lisatu di tissutu deve esse sguassatu cumplettamente durante u prucessu d'estrazione, è u lavatu deve esse abbastanza per chì i muri circundanti di u tubu ponu esse lavati.Inoltre, u tubu hè viotu è soffiatu hè un passu necessariu, chì riducerà ancu u residu di materia urganica.
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Postu tempu: Dec-01-2022
